葛根素對心肌纖維化模型小鼠左心室中Ⅰ型膠原表達的影響

唐 婕,陳 蓉,謝梅林

(1.蘇州大學附屬第一醫院藥學部,江蘇蘇州,215006;2.蘇州大學藥學院藥理系,江蘇蘇州,215123)

多種心血管疾病如心肌梗死、慢性充血性心力衰竭、心房顫動、高血壓心臟損害、糖尿病性心肌病變、心肌病及心肌炎等,都伴有心肌重構的病理過程,而心肌纖維化(MF)是心肌重構的重要環節,切實有效的防治MF受到高度關注[1]。葛根素(Pue)為異黃酮類藥物,系豆科植物野葛干燥根中的提取物,臨床用于治療多種心血管疾病。本研究探討葛根素對異丙腎上腺(ISO)誘導的MF模型小鼠左心室Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)表達的影響,對闡述葛根素和MF的關系有一定理論意義和潛在的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥品與動物

倒置顯微鏡XDS-1B型(重慶光學儀器廠);722型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);DS-671電子秤(上海寺岡電子有限公司);80-2型臺式低速離心機(上海醫療器械集團有限公司);PK-S22電熱恒溫水浴鍋(上海精宏儀器設備有限公司);MR23i高速冷凍離心機(法國Jouan公司);MyCycler TM型PCR儀(美國Biorad公司)。葛根素(蘇州長征制藥廠饋贈,純度≥99%,批號:080301);卡托普利(中美上海施貴寶制藥有限公司,批號:0810031);異丙腎上腺素(ISO)(上海禾豐制藥有限公司,批號:080701);羥脯氨酸(Hydro)試劑盒(南京建成生物公司,批號:20081202)。其余試劑為分析純。CollagenⅠ引物購自上海生工科技公司。清潔級昆明種雄性小鼠(蘇州大學實驗動物中心),體質量22～25 g。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法及造模:葛根素低劑量(600 mg/kg)組、葛根素高劑量(1200 mg/kg)組及陽性藥對照(卡托普利,25 mg/kg)組預先在上午灌胃給藥3d后,同時在下午皮下注射ISO 5 mg/kg 1 d,后以2.5 mg/kg維持至30 d。停止注射ISO后,再繼續給藥1周。MF模型組以ISO5 mg/kg皮下注射1 d后,以2.5 mg/kg維持至30 d;溶媒對照組上午以0.5%的CMC-Na灌胃(葛根素用0.5%的CMC-Na溶液配制),3 d后在下午同時皮下注射生理鹽水至30 d。停止注射生理鹽水后,再繼續以0.5%的CMC-Na灌胃1周。

1.2.2 心重指數(CWI)測定:末次給藥后次日,5組小鼠稱重,頸椎脫臼處死小鼠,取小鼠心臟,稱重,計算CWI。

1.2.3 Hydro含量測定:采用消化法檢測小鼠心肌組織Hydro含量,組織中的膠原經酶消化產生Hydro,Hydro在氧化劑的作用下所產生的氧化產物與二甲氨基苯甲醛作用呈現紫紅色,在550 nm測定Hydro含量,具體操作按照Hydro測定試劑盒。考馬斯亮藍法測定總蛋白含量,具體操作按照總蛋白測定試劑盒。

1.2.4 CollagenⅠ mRNA測定:左心室勻漿后,用TRIzol提取總RNA,進行反轉錄和PCR。CollagenⅠ的引物:上游 5′-ACGTCCTGGTGAAGTT GGTC-3′,下 5′-CAGGGAAGCCTCTTTCTCCT-3′,擴增片段長度為169 bp,退火溫度為55℃。GAPDH 的引物:上游5′-GTATGACGTGGAGTC TACTG-3′, 下游 5′-TACTCCTTGGAGGCCATG TA-3′,擴增片段長度為728bp,退火溫度為56℃。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳,結果經凝膠掃描圖像處理系統分析,以CollagenⅠ基因擴增帶灰度與同管擴增的GAPDH基因擴增帶灰度之比表示CollagenⅠmRNA表達水平。

2 結 果

2.1 對CWI和心肌Hydro含量的影響

CWI按照“CWI(mg/g)=全心質量/體質量”計算。Hydro含量按照試劑盒說明書的公式計算。結果顯示,與溶媒對照組相比,模型組CWI和Hydro含量明顯增加(P<0.01);與模型組相比,葛根素給藥組均可降低CWI和Hydro含量,其中CWI降低了7.12%～10.15%,Hydro含量降低了18.28%～19.53%(P<0.05或P<0.01)。陽性藥卡托普利組與模型組比較,CWI和Hydro含量也明顯降低(P<0.01),見表1。

表1 葛根素對ISO誘導MF小鼠CWI、Hydro含量和CollagenⅠmRNA表達的影響(,n=8)

表1 葛根素對ISO誘導MF小鼠CWI、Hydro含量和CollagenⅠmRNA表達的影響(,n=8)

與溶媒對照組比較,＊P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組別 劑量(mg·kg-1) CWI(mg·g-1) Hydro(mg·g-1protein) CollagenⅠmRNA溶媒對照組3.75±0.17 4.58±0.51 0.21±0.03模型組 4.63±0.36＊ 5.58±0.63＊ 1.45±0.23＊葛根素低劑量組 600 4.30±0.21# 4.56±0.30## 0.98±0.21##葛根素高劑量組 1200 4.16±0.10## 4.49±0.86## 0.46±0.08##卡托普利組 25 4.20±0.37# 4.45±0.85## 0.65±0.07##

2.2 對左心室CollagenⅠmRNA表達的影響

模型組CollagenⅠmRNA表達明顯增加,與正常對照組比較差異顯著(P<0.01);葛根素給藥組與模型組比較,CollagenⅠmRNA表達明顯降低(P<0.01)。陽性藥卡托普利組與模型組比較,CollagenⅠmRNA表達也明顯降低(P<0.01),見表1。

3 討 論

MF涉及的病因較多,不同病因所致膠原和心肌重構的具體機制不盡相同。從總體上講,心肌膠原的異常蓄積是膠原生成大于膠原降解的結果,膠原生成與降解之間的動態平衡,涉及一系列的調控因素,而且這些因素之間存在著錯綜復雜的相互依存與相互制約關系。一旦這種平衡被破壞,膠原產生增多或降解減少,均可使膠原過多沉積,其中主要以CollagenⅠ為主,導致心室順應性下降,影響心臟的正常收縮與舒張功能[2]。

本實驗采用ISO誘導小鼠MF,表現為CWI,心肌Hydro含量明顯增加,結果證明在小鼠身上成功的復制了ISO致MF的模型,改造模方法接近疾病進程,且相對無創、動物死亡率低,與其他文獻的報道相一致[3-4]。本實驗采用葛根素預防給藥,可見MF小鼠的CWI、心肌 Hydro含量明顯降低,說明葛根素能減輕MF的發展。RTPCR方法顯示,用葛根素預防給藥的MF小鼠左心室中CollagenⅠmRNA水平明顯降低,由此推測,葛根素預防ISO誘導的小鼠MF的作用可能與抑制CollagenⅠ的表達有關,具體的作用機制還有待進一步研究。

[1]Cohn J N,Ferrari R,Sharpe N.Cardiac remodeling-concepts and clinical implications:a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.Behalf of an International Forum on Cardiac Remo deling[J].J Am Coll Cardiol,2000,35(3):569.

[2]徐冬玲,劉偉華,杜貽盟,等.PPARγ在糖尿病心肌纖維化大鼠心肌細胞及微血管內皮中的表達[J].山東大學學報,2008,46(9):847.

[3]李明,張軍,陳燕,等.丹參抑制異丙腎上腺素引起的小鼠心肌肥厚和纖維化及其作用機制[J].中國藥科大學學報,2003,34(6):565.

[4]鄧瑋,陳慶偉,李興升,等.小鼠心肌纖維化模型的制備及其膠原沉積的機制[J].中國實驗動物學報,2011,19(2):103.