祛濕除痹復方對急性痛風性關節炎模型大鼠關節癥狀的作用及其機制*

姚 紅， 陳建雄， 童 娟

(廣州醫學院第一附屬醫院中醫科，廣東 廣州 510120)

1000-4718(2012)07-1292-05

2012-05-08

2012-07-03

廣東省自然科學基金資助項目(No.9451018201003652);廣東省中醫藥局課題(No.2009253)

△通訊作者：Tel:020-83062043;E-mail:quen918@yahoo.com.cn

祛濕除痹復方對急性痛風性關節炎模型大鼠關節癥狀的作用及其機制*

姚 紅， 陳建雄， 童 娟△

(廣州醫學院第一附屬醫院中醫科，廣東 廣州 510120)

目的探討祛濕除痹復方對大鼠急性痛風性關節炎的可能作用機制，驗證急性痛風性關節炎的濕熱痹阻病機。方法將40只Wistar大鼠隨機分5組，每組8只，即空白組、模型組、秋水仙堿組、中藥低劑量組和中藥高劑量組。采用尿酸單鈉晶體溶液踝關節注射法建立急性痛風性關節炎模型。以祛濕除痹復方與秋水仙堿對比治療，觀察祛濕除痹復方對大鼠關節各種癥狀(炎癥、腫脹度及活動障礙)及大鼠關節組織內白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素1受體(IL-1R)和髓樣分化因子88(MyD88)表達水平的影響。結果灌胃給藥7 d后秋水仙堿組和中藥各劑量組與模型組比較，大鼠關節腫脹程度差異顯著(P<0.01), 秋水仙堿組和中藥高劑量組比較差異有統計學意義(P<0.05)。各組大鼠關節炎癥指數及功能障礙指數積分比較，模型組積分最高。造模后8和72 h各組積分均降低(P<0.05)，模型組與各用藥組比較差異顯著 (P<0.05)。關節軟組織內IL-1β、IL-1R及MyD88的平均吸光度以模型組為最高，中藥低劑量組和秋水仙堿組比較無明顯差異(P>0.05)，而與中藥高劑量組比較有顯著差異(P<0.05)。結論祛濕除痹復方能有效抑制實驗性急性痛風性關節炎大鼠關節組織內炎癥因子的表達，從而改善模型大鼠各種關節癥狀。

中草藥； 關節炎，痛風性； 細胞因子類

痛風(gout)是由于嘌呤代謝紊亂導致血尿酸水平增高,尿酸鹽結晶沉積于關節滑膜及其它組織中引起的一組代謝性疾病[1]。痛風性關節炎急性發作期，沉積在關節腔內的尿酸鈉晶體刺激炎癥細胞，釋放炎癥因子，其中白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)、白細胞介素1受體(interleukin-1R,IL-1R)以及信號轉導途徑中的主要接頭蛋白髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)在痛風的關節炎癥反應過程中起著至關重要的作用。白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)是IL-1存在于關節滑膜內的主要形式，是引起關節破壞和誘導痛風性關節炎急性發作期關鍵的炎癥因子[2-3]。中醫認為，痛風性關節炎之急性期臨床多見紅腫熱痛等濕熱痹阻為特征的表現，采用祛濕除痹法治療痛風療效肯定且毒副作用很小。本實驗通過觀察祛濕除痹復方對痛風性關節炎大鼠關節癥狀的改善及關節軟組織內IL-1β、IL-1R及MyD88表達的影響，探討祛濕除痹復方對急性期痛風性關節炎關節癥狀的作用及機制。

材 料 和 方 法

1動物

Wistar大鼠40只，雄性，180～200 g(由南方醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK粵2006-0015)，飼養環境：廣州醫學院實驗動物中心SPF級實驗室(許可證號為4402100561)。

2主要試劑

尿酸單鈉(monosodium urate,MSU;Sigma)；大鼠免疫組化試劑盒(Abcam;包括抗IL-1β抗體，抗IL-1R抗體，抗MyD88抗體)；DAB顯色試劑盒(深圳杰特偉生物科技有限公司)；動態濁度法鱟試劑(廈門市鱟試劑實驗廠有限公司生產)。祛濕除痹復方(七葉蓮、土茯苓和萆薢，由廣州醫學院第一附屬醫院中藥房提供)。秋水仙堿(50 mg, 片劑，西雙版納藥業有限公司生產)。

3主要方法

3.1MSU結晶及MSU溶液的制備[4]無菌條件下將 800 mg MSU和155 mL生理鹽水混合，置于燒瓶中加熱煮沸至MSU完全溶解，迅速小滴滴入1 mol/L HCl調整pH值至7.0±0.2，自然降溫后于3 000 r/min離心，離心至晶體不再析出后，置于4 ℃冰箱保存備用，用前混懸于PBS緩沖液中配成所需濃度。采用鱟試劑動態濁度法檢測內毒素，內毒素<0.0625Eu/mL (Eu為內毒素單位)。

3.2中藥制備 七葉蓮、土茯苓和萆薢按1∶1∶1比列放置在套式恒溫器中，加入蒸餾水，水量為藥材的10倍，武火煮沸后改文火煎煮2 h，濾出藥液，藥渣加入8倍水繼續煎煮2 h，2次濾液合并，蒸餾懸蒸濃縮藥液至2 kg/L，冰箱保存備用。

3.3動物分組及給藥方法 大鼠隨機分為5組,每組8只,即空白組、模型組、秋水仙堿組和中藥低劑量組、中藥高劑量組。根據藥物劑量換算公式[5]，中藥低劑量組給予27 g·kg-1·d-1(相當于成人臨床常規用量)中藥；中藥高劑量組給予54 g· kg-1·d-1(相當于臨床用量的2倍) 中藥；秋水仙堿組給予0.009 g·kg-1·d-1秋水仙堿；空白組及模型組予以蒸餾水10 mL·kg-1·d-1。造模后當天各組開始分別給予相應藥物或蒸餾水，每天(早上9點)1次，連續灌胃7 d。

3.4大鼠急性痛風性關節炎模型的制備 參照改良后的Cdoerre造模方法[6]。適應性喂養大鼠3 d后開始造模。空白組不做任何處理，其余4組大鼠腹腔注射水合氯醛30 mg/kg麻醉，選受試大鼠左側踝關節背側，常規消毒后，用4.5號注射針與脛骨成45方向插入踝關節，將0.1 mL MSU溶液(50 g/L)注入到踝關節腔，形成大鼠關節局部紅腫熱脹并不同程度的跛行，即大鼠急性痛風性關節炎模型。第7 d灌胃后3 h處死大鼠取材。

3.5炎癥指數及功能障礙指數測定 根據Coderre炎癥指數及功能障礙指數分級評定標準[7]，造模后8和72 h分別觀察大鼠炎癥指數及功能障礙指數。

3.5.1炎癥指數分級標準 0：正常；1：關節皮膚紅斑，輕度腫脹，骨性標志可見；2：關節明顯紅腫，骨性標志消失，但腫脹局限于關節部位；3：關節以外肢體腫脹。

3.5.2功能障礙指數分級標準 0：正常步態，雙足均勻著地；1：足著地減輕，足趾未展開，輕度跛行；2：足屈起，趾背著地，明顯跛行；3：足完全離地，呈3足行走步態。

3.6大鼠關節腫脹度(足跖容積的變化)測定[7]造模前3 d開始,用記號筆在大鼠左后肢踝關節周圍作上記號并拉直,放入足跖容積測定儀內,使足標記與其刻度相平,測量每只鼠未注射MSU晶體溶液前左后足容積并記錄。注射MSU晶體溶液后2 h再次測量大鼠左后足容積并記錄，根據注射MSU前后大鼠左后足容積之差計算足跖腫脹度(mL)。注射MSU后2 h的測量值為造模后第1 d測量值。以后每天灌胃前測量大鼠關節腫脹度，連續測量7 d。

3.7關節軟組織免疫組化法檢測 石蠟切片常規脫蠟至水化，過氧化氫去內源性酶，胰酶消化暴露抗原，滴加Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，依次滴加生物素標記Ⅱ抗、酶標記鏈霉卵白素過氧化物酶，DAB顯色。光鏡下(×400)觀察，將呈現棕黃色的區域視為陽性目標，每張切片選3個胞漿內棕黃色著色最深、面積最大的視野區域，測量陽性著色面積及積分吸光度值。測量參數選擇：(1)面積；(2)積分吸光度；(3)平均吸光度。圖像分割選彩色HSV分割。經計算機攝像系統選擇采樣后，采用Image Pro-Plus 6.0圖像處理分析軟件對信號強度進行定量分析，得出陽性染色面積(area)及積分吸光度值(integral absorbance values，IA)，以3個視野所得數據平均值代表樣本的陽性結果。以測量照片上全部被選中的棕黃色的吸光度總和(IASum)與陽性面積(area)的比值作為平均吸光度(mean absorbance)值，即平均吸光度 = (IASum) / area。平均吸光度是沒有單位的相對數值。

4統計學處理

結 果

1各組大鼠炎癥指數及功能障礙指數積分比較

各組大鼠造模后炎癥指數及功能障礙指數積分均有不同程度的升高，且模型組的積分在造模8 h、72 h均比其余用藥組高，顯著差異(P<0.05)；造模后72 h與8 h相比較，各組大鼠炎癥指數及功能障礙指數積分有下降趨勢，差異顯著(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠炎癥指數積分及功能障礙指數積分比較

▲P<0.05vsmodel group；*P<0.05vs8 h.

2各組大鼠左足跖腫脹度的比較

造模后2 h(即第1 d)起直到第7 d，模型組、秋水仙堿組、中藥低劑量組、中藥高劑量組大鼠足腫脹度均比空白組高，差異顯著(P<0.01)，除空白組外，其余4組間足腫脹度比較無顯著差異(P>0.05)；造模后第7 d，各用藥組與模型組比較，大鼠足腫脹程度均有所緩解(降低)，差異顯著(P<0.01)，秋水仙堿組與中藥低劑量組比較無顯著差異(P>0.05)，而中藥高劑量組則比秋水仙堿組降低，顯著差異(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠左足跖腫脹度的比較

△△P<0.01vsblank group；▲▲P<0.01vsmodel group；*P<0.05vsTCM high-dose group.

3各藥物組對IL-1β、IL-1R和MyD88表達的影響

模型組、秋水仙堿組、中藥各劑量組與空白組比較，IL-1β、IL-1R和MyD88平均吸光度均升高，差異顯著(P<0.01)。而各藥物治療組IL-1β、IL-1R和MyD88平均吸光度均較模型組低，且差異有統計學意義(P<0.05)。秋水仙堿組、中藥低劑量組與中藥高劑量組比較，IL-1β、IL-1R和MyD88平均吸光度均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，而秋水仙堿組與中藥低劑量組之間比較無顯著差異(P>0.05)，見圖1～3和表3。

Figure 1. The IL-1β expression in joint and soft tissues of rats(immunohistochemical staining,×400).A:blank group;B:model group;C:colchicines group;D:TCM low-dose group;E:TCM high-dose group.

圖1大鼠關節軟組織IL-1β表達

Figure 2. The IL-1R expression in joint and soft tissues of rats (immunohistochemical staining,×400).A:blank group;B:model group;C:colchicines group;D:TCM low-dose group;E:TCM high-dose group.

圖2大鼠關節軟組織IL-1R表達

Figure 3. The MyD88 expression in joint and soft tissues of rats (immunohistochemical staining, ×400).A:blank group;B:model group;C:colchicines group;D:TCM low-dose group;E:TCM high-dose group.

圖3大鼠關節軟組織MyD88表達

表3 各組大鼠IL-1β、IL-1R和MyD88表達的比較

△△P<0.01vsblank group；▲P<0.05vsmodel group；*P<0.05vsTCM high-dose group.

4大鼠足腫脹度與關節內炎癥因子相關性分析

大鼠足腫脹度與關節內IL-1表達的相關系數為r=0.706，大鼠足腫脹度與關節內IL-1R表達水平之間的相關系數為r=0.720，均P<0.01，呈正相關性。

討 論

本實驗運用已公認的大鼠踝關節內注入MSU晶體溶液制備急性痛風性關節炎模型的方法,造模后大鼠關節出現紅、腫、熱和功能障礙等表現, 其病理表現與臨床急性痛風性關節炎極為相似,充分地模擬了人類急性痛風性關節炎的發作過程。實驗結果表明，造模后8和72 h，秋水仙堿組、中藥低劑量組及高劑量組的關節炎癥指數和功能障礙指數與模型組比較，積分均降低并有顯著性差異，3個用藥組之間無明顯差異。在灌胃第7 d，模型組大鼠關節腫脹度最高，與秋水仙堿組、中藥各劑量組比較有顯著差異，說明藥物對關節腫脹起到了抑制作用，中藥低劑量組與秋水仙堿組之間無顯著差異，而中藥高劑量組的腫脹度低于秋水仙堿組，說明中藥高劑量組具有更強的關節消腫作用，其治療后關節消腫效果更接近空白組。實驗結果提示，中藥各組和秋水仙堿均能緩解急性痛風性關節炎大鼠的關節腫脹等癥狀。

在痛風性關節炎急性發作期，炎癥細胞異常活躍。沉積于關節內的尿酸結晶,被多形核白細胞和關節囊滑膜內層細胞吞噬, 吞噬尿酸鹽的白細胞迅速脫顆粒、分解，激活炎性復活體，釋放炎癥趨化因子，使白細胞介素類細胞因子活化，募集更多的白細胞聚集，進行趨化運動，引起免疫級聯反應，導致關節組織炎癥和破壞性病變[8]。由細胞因子介導的炎癥是痛風性關節炎的核心所在。IL-1是人類主要的致炎細胞因子,它通過IL-1轉換酶分泌到細胞膜的外面發揮致炎作用，在痛風性關節炎的發展過程中起重要作用[9-10]。IL-1主要分為IL-1α和IL-1β，在血液中IL-1α和IL-1β同時存在，在關節中主要以IL-1β為主。IL-1的作用主要通過TLR/MyD88信號通路產生。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)可激活細胞內的信號轉導通路觸發免疫系統。MyD88是負責承接TLR 活化信號的主要接頭蛋白[11]。由此推測，若能在痛風性關節炎急性發作期阻斷IL-1R的表達可減少IL-1R相關激酶(IL-1 receptor-associated kinase， IRAK-1)產生、降低MyD88的結合率使血清內和關節組織內的炎癥因子含量減少，從而達到緩解炎癥的作用。在5組關節組織內IL-1β、IL-1R和MyD88平均吸光度值的結果顯示：空白組最低，與其余4組比較均有統計學意義；模型組高于各用藥組并具有統計學意義。中藥高劑量組低于秋水仙堿組和中藥低劑量組，與此兩組比較有統計學意義。說明各用藥組均可抑制TLR/MyD88信號通路，減少炎癥因子的產生及活化。其作用隨中藥劑量的增加而增強。我們發現造模7 d后各組大鼠足腫脹度與關節內炎癥因子的表達水平呈現正相關，提示炎癥因子表達水平的變化直接影響模型大鼠關節腫脹等癥狀的改善。

綜上所述，祛濕除痹復方可能通過阻斷TLR/MyD88信號通路，減少炎癥因子的產生，從而改善急性痛風性關節炎關節腫脹等癥狀，可以認為該復方在痛風性關節炎急性期的治療是以抗炎治療為主。但單味藥及其活性成分的抗痛風性炎癥的作用及其機制有待深入研究。

[1] Pascual E, Pedraz T. Gout [J]. Curr Opin Rheumatol,2004,16(3):282-286.

[2] O’Neill LA. The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor superfamily: 10 years of progress[J].Immunol Rev,2008,226:10-18.

[3] 劉 挺, 劉元祿, 高 岱, 等.痛風定膠囊對實驗性骨膜組織IL-8和TNF-α影響的研究[J]. 中國中醫骨傷科雜志,2005, 13(1):24-26.

[4] 黃火高, 孫運峰, 胡 明,等. 大鼠急性痛風性關節炎模型的建立及特點[J]. 軍事醫學科學院院刊, 2005，29(6):538-542.

[5] 趙 偉,孫國志.不同種實驗動物間用藥量換算[J].畜牧獸醫科技信息，2010,(5)：52-53.

[6] 姚 麗,劉樹民,于書儀.痛風性關節炎動物模型的改良[J]. 中國實驗動物學報，2009，17(3)：210-212.

[7] 劉曉玲,劉 瓊, 陳光星，等.通痹合劑對佐劑性關節炎模型大鼠軟骨保護作用的機制研究[J]. 廣州中醫藥大學學報, 2010，27(3)：246-249，318.

[8] Renner P,Roger T,Calandra T,et al. Macrophage migration inhibitory factor gene polymorphisms and susceptibility to inflammatory diseases[J].Clin Infect Dis,2005，41(Suppl 7)：S513-S519.

[9] Palmer G,Guerne PA ,Mezin F, et al. Production of interleukin- 1 receptor antagonist by human articular chondro-cytes[ J]. Arthritis Res, 2002, 4(8): 226-231.

[10]嵇 波，劉清國，符永鋆，等. 針刀松解法、電針對膝關節骨關節炎兔IL-1β、IL-6、TNF-α含量影響的比較[J].中國病理生理雜志， 2009, 25(6):1165-1169.

[11]Fernandes JC,Martel-Pelletier J, Pelletier JP. The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology[J]. Biorheology, 2002, 39(1-2): 237-246.

Anti-arthralgiceffectsofQushi-Chubicompoundprescriptiononacutegoutyarthritisinrats

YAO Hong, CHEN Jian-xiong, TONG Juan

(DepartmentofChineseTraditionalMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:quen918@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the role of arthralgia due to dampness in the pathogenesis of acute gouty arthritis and to observe the anti-arthralgic effects of Qushi-Chubi compound prescription of traditional Chinese medicines (TCM) on gouty arthritis in a rat model.METHODSForty SPF Wistar rats were randomly divided into 5 groups: blank group, model group, colchicine group, TCM low-dose group and TCM high-dose group. Monosodium urate crystals were injected into the rat ankle to induce acute gouty arthritis. The decoction of Qushi-Chubi compound prescription was given intragastrically for 7 days. Colchicine was used as a positive model drug in the model rats. The expression levels of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-1 receptor (IL-1R) and myeloid differentiation factor 88 (MyD88) in the joint tissues were observed.RESULTSSeven days after intragastrical administration, the degrees of joint swelling in colchicine group and TCM treatment groups were significantly lower than that in model group (P<0.01), and that in TCM high-dose group was even lower than that in colchicine group with statistical significance. The index of inflammatory responses and joint dysfunction in model group was the highest and was higher than those in colchicine group and TCM treatment groups. The serum levels of IL-1β and IL-1R in TCM high-dose group were significantly lower than those in model group and colchicine group (P<0.05).CONCLUSIONThe Qushi-Chubi compound prescription effectively inhibits the expression of inflammatory cytokines in rats with acute gouty arthritis, and also attenuates the inflammatory responses of the arthralgia joints.

Drugs, Chinese herbal; Arthritis, gouty; Cytokines

R285.6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.026