ox－LDL 對巨噬細胞內皮脂肪酶表達的影響*

吳曉倩，宜 全，何麗姍

(廣州醫學院藥理教研室，廣東 廣州510182)

心腦血管疾病位居人類疾病譜首位，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是其主要病理基礎。血漿高密度脂蛋白膽固醇(high－density lipoprotein cholesterol，HDL－C)水平與冠心病的發病率呈顯著負相關，提高血漿HDL－C 已被證實是防治動脈粥樣硬化類疾病的重要策略［1］。內皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)是HDL 代謝的關鍵酶［2］，由內皮細胞合成，以旁分泌的方式在血管局部發揮作用。Ishida等［3］在Apo－E 基因敲除小鼠中研究發現，EL 介導單核細胞向發生粥樣硬化區域游走并黏附，下調HDL 水平，EL 與Apo－E 基因雙敲除小鼠發生動脈粥樣硬化的敏感性上升，提示EL 可能通過調節HDL代謝參與動脈粥樣硬化的發生發展。EL 在動脈粥樣硬化患者冠狀動脈內皮細胞、中膜血管平滑肌細胞、吞噬細胞及粥樣斑塊新生血管中都有表達［4］。然而EL 在動脈粥樣硬化中的表達調控并不十分明確。氧化低密度脂蛋白(oxidized low－density lipoprotein，ox－LDL)是促動脈粥樣硬化形成和發展的關鍵因素，參與內皮功能損傷、泡沫細胞形成和炎癥的發生等。ox－LDL 是否影響EL 的表達，尚未見國內、外文獻報道。本實驗采用鼠源RAW264.7 巨噬細胞研究ox－LDL 對EL 表達的影響及其可能機制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

鼠源RAW264.7 巨噬細胞由中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫提供。DMEM 高糖培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco。BCA 蛋白定量試劑盒和增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購自Pierce。蛋白電泳分子量(7 ～175 kD)標記和EL 抗體、α－tubulin 抗體、NF－κB p65 抗體和IκBα 抗體購自Cell Signaling。核蛋白抽提試劑盒(cell nuclear extraction kit)和PDTC購自Sigma。Histone H1 抗體、抗兔Ⅱ抗和抗小鼠Ⅱ抗購自Santa Cruz。其余試劑均為分析純產品。

2 ox－LDL 的制備和鑒定［5］

采用序列超速離心法分離健康人新鮮血漿低密度脂蛋白，經瓊脂糖電泳、十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳均顯示為單一蛋白條帶。提純的LDL用不含EDTA 的PBS 液透析48 h，隨后在含10 μmol/L CuSO4的PBS 液(pH 7.2)中37 ℃溫育透析12 h，最后在含100 μmol/L EDTA 的PBS 中4 ℃透析24 h。過濾除菌、定量，用PBS 調蛋白濃度至1 g/L，4 ℃保存備用。取氧化前后的LDL，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

3 細胞培養與實驗分組

正常生長的RAW264.7 巨噬細胞用高糖DMEM培養基(含10% 胎牛血清)調節細胞密度至1.25 ×108/L，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。細胞同步化24 h。隨機分組，分別用(0 ～100 mg/L)ox－LDL 孵育細胞24 h;PDTC 預孵育細胞30 min 后再加50 mg/L ox－LDL 孵育24 h。

4 EL 表達檢測

細胞處理后，用細胞刮刮下細胞，PBS 洗滌，RIPA 裂解細胞，10 000 ×g、4 ℃離心30 min，取上清，定量。Western blotting 主要步驟如下:經SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉。5%脫脂牛奶于室溫振蕩封閉60 min，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，TBS 緩沖液沖洗，Ⅱ抗室溫孵育2 h，TBS 緩沖液沖洗，曝光，采用Image－Pro Plus 軟件分析條帶A 值，α－tubulin 為內參照。實驗重復3 次。

5 核蛋白提取與NF－κB、IκBα 檢測

參照Sigma 公司試劑盒說明書進行核蛋白提取，主要步驟如下:收集細胞，加lysis buffer 冰上孵育15 min，加Igepal CA－630 劇烈渦旋10 s，10 000 ×g、4℃離心30 s，取上清得胞漿蛋白，用于檢測IκBα 表達;沉淀為細胞核，加extract buffer 重懸細胞核，冰上孵育30 min，并不斷劇烈渦旋。20 000×g、4 ℃離心5 min，取上清用于檢測NF－κB p65 亞基表達。Western blotting 同上述方法。Histone H1 為核蛋白內參照，α－tubulin 為胞漿蛋白內參照。實驗重復3 次。

6 統計學處理

結 果

1 ox－LDL 對RAW264.7 細胞EL 表達的影響

不同濃度(0 ～100 mg/L)的ox－LDL 孵育RAW264.7 細胞使EL 蛋白表達增加。50 mg/L ox－LDL 達到高峰，為空白對照組的(1.92 ±0.34)倍(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1. Effect of ox－LDL on EL protein expression in RAW264.7 cells. ±s. n =3. *P ＜0.05 vs control(0 mg/L).圖1 ox－LDL 對RAW264.7 細胞EL 表達的影響

2 ox－LDL 刺激RAW264.7 細胞NF－κB 活化

50 mg/L ox－LDL 作用于RAW264.7 細胞15 min IκBα 開始降解，30 min 幾乎降解到最低。同時NF－κB p65 表達開始增加，15 ～30 min 增加到最高，見圖2。

3 PDTC 抑制ox－LDL 誘導的RAW264.7 細胞EL 表達增加

NF－κB 阻斷劑PDTC 預孵育細胞30 min，再用50 mg/L ox－LDL 孵育細胞24 h 后發現，PDTC+ox－LDL 組EL 蛋白表達水平比ox－LDL 組明顯下降(P ＜0.05)，見圖3。

討 論

Figure 2. ox－LDL induced activation of NF－κB in RAW264.7 cells. ±s. n=3. *P ＜0.05 vs control (0 min).圖2 ox－LDL 刺激RAW264.7 細胞NF－κB 活化

Figure 3. The increased EL expression induced by ox－LDL was inhibited by PDTC. The RAW264.7 cells were treated with 50 mg/L ox－LDL for 24 h with or without pretreatment with 100 μmol/L of PDTC for 30 min. ±s. n =6. ＊＊P ＜0. 01 vs control;#P ＜0. 05 vs ox－LDL.圖3 PDTC 抑制ox－LDL 誘導的RAW264.7 細胞EL 表達增加

EL 是1999 年被發現的甘油三酯脂肪酶家族的新成員。與肝脂肪酶和脂蛋白脂肪酶不同，EL 具有較強的磷脂酶活性。HDL 被證明是EL 的特異性底物［6］。EL 升高會導致血漿HDL－C、apoA－I 水平明顯下降［7］，而EL 基因突變則會引起血漿HDL 增高［8－9］。而且，EL 對HDL 的水解作用存在明顯的劑量依賴性:給小鼠注射不同劑量含EL cDNA 的重組腺病毒后出現劑量依賴性的血漿磷脂酶活性上升和磷脂、HDL、apoA－I 水平下降［10］。這些研究表明，EL 與體內HDL 水平密切相關。HDL－C 負責體內膽固醇逆向轉運，提高血漿HDL－C 被證實是防治動脈粥樣硬化類疾病的重要策略。因此，明確EL 表達的調控、改善HDL－C 水平可能為治療動脈粥樣硬化提供新的思路。

ox－LDL 被認為是動脈粥樣硬化的關鍵致病因素，介導巨噬細胞泡沫化、炎癥細胞浸潤、內皮細胞損傷、血管平滑肌細胞遷移等，貫穿動脈粥樣硬化發展的整個過程。然而ox－LDL 是否影響EL 表達尚未見報道，本研究發現ox－LDL 劑量依賴性地增加EL 的表達。也有文獻報道，AS 相關炎癥因子TNFα、IL－1β 是通過NF－κB 通路上調EL mRNA 和蛋白水平及其酶活性［11］。這些研究與我們的實驗結果提示EL 可能受到ox－LDL、炎癥因子的調控參與動脈粥樣硬化過程。

NF－κB 是一個氧化－還原敏感性核轉錄因子，主要由p50 和p65 2 個亞基組成。靜息狀態下，NF－κB 由于被其天然抑制劑IκBs (IκBα、β、ε、ζ)蛋白包裹在胞漿中處于失活狀態;當細胞受到某些刺激(如氧化應激、炎癥等)，IKKα/β 蛋白激酶催化IκBs絲氨酸殘基磷酸化(Ser32 和Ser36)繼而被26S 蛋白酶體降解，使得NF－κB p65 亞單位釋放并從細胞質移位到細胞核，與靶基因上啟動子的特定序列結合，啟動多種靶基因轉錄和蛋白質表達，參與動脈粥樣硬化過程［12］。本實驗結果表明，ox－LDL 刺激RAW264.7 細胞15 min 胞漿中IκBα 降解增多，而核NF－κB p65 亞單位磷酸化增加，提示NF－κB 被激活。為研究NF－κB 是否參與ox－LDL 刺激引起的EL 表達增加，我們采用NF－κB 抑制劑PDTC 預處理細胞1 h 后發現，ox－LDL 引起的EL 表達增加被抑制。這提示ox－LDL 可能通過NF－κB 途徑上調EL 的表達。

綜上所述，本研究發現ox－LDL 能夠劑量依賴性地增加EL 表達，該作用可能由NF－κB 介導。然而EL 在動脈粥樣硬化中的作用以及以EL 為靶點、以HDL 為底物的藥物篩選體系建立的可能性還有待進一步研究，以期為開發以調節HDL 水平治療動脈粥樣硬化的藥物提供新的思路。

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