細胞因子信號抑制因子3在小鼠腎炎進程中的表達*

許文頻， 沈 楠， 張二娟， 李 敏， 李衛東

(北京大學醫學部基礎醫學院藥理學系， 北京 100191)

1000-4718(2012)07-1287-05

2012-02-01

2012-04-12

國家自然科學基金資助項目(No. 81173069)；北京市自然科學基金資助項目(No.7102100)

△ 通訊作者 Tel: 010-82802798；E-mail: lwdpharma@126.com

細胞因子信號抑制因子3在小鼠腎炎進程中的表達*

許文頻， 沈 楠， 張二娟， 李 敏， 李衛東△

(北京大學醫學部基礎醫學院藥理學系， 北京 100191)

目的探索細胞因子信號抑制因子3(SOCS3)在小鼠腎炎進程中的表達變化規律和意義。方法采用含兔抗小鼠腎小球基底膜抗體的腎毒素血清(NTS)制備小鼠腎炎模型。在第10、15、20和25 d分別收集小鼠尿液并摘取腎臟。以蛋白尿水平、腎臟組織HE和Masson染色評價腎炎進程；采用免疫組化和Western blotting 法檢測SOCS3蛋白表達變化，以及Janus激酶2(JAK2)和信號轉導及轉錄激活因子3(STAT3)在小鼠腎炎進程中磷酸化情況。結果小鼠腎炎模型表現出典型的發病、進展與轉歸；SOCS3在腎炎進程中未出現立即隨JAK2和STAT3磷酸化增多而表達增加的現象，僅在腎炎嚴重期(第20 d)表達增加(P<0.05)，在恢復期(第25 d)表達明顯增加(P<0.01)。恢復期SOCS3表達顯著增加，表現出抑制JAK2和STAT3磷酸化的作用。結論機體自身條件下，SOCS3的表達未立即隨JAK2/STAT3磷酸化增多而增加，SOCS3對免疫性腎炎的保護作用可能主要在腎炎恢復期。

細胞因子信號抑制因子； 腎毒素血清； 負調控； 信號通路

細胞因子信號抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)家族是以SH2結構域為核心結構，C端具有保守的40個氨基酸模塊——SOCS盒的胞漿蛋白分子家族[1]。該家族可在多種細胞內表達或誘導表達。該家族主要功能的發揮是通過蛋白中SH2結構與Janus激酶(Janus kinase，JAK)或細胞因子受體中磷酸化的酪氨酸相結合，抑制細胞因子信號轉導級聯反應。 SOCS3作為SOCS家族的重要分子，目前已有大量研究表明其可被多種炎癥因子和抗炎因子誘導表達，如白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)等，從而負調控機體免疫應答反應而避免機體遭受免疫損傷[2]。炎癥刺激產生的IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等炎癥因子通過細胞膜表面受體激活JAK2/信號轉導及轉錄激活因子3(signal trainsducer and activator of transcription 3,STAT3)，引起SOCS3的表達增多，是SOCS3表達上調的重要途徑[3]。

免疫性腎炎是免疫性疾病中最嚴重的病癥之一，該病患者的生活質量嚴重受影響。該疾病的重要病因是腎小球基底膜抗原抗體復合物沉積或對自身抗原產生抗原抗體反應，引起自身免疫細胞攻擊而導致腎組織損傷。在腎炎損傷過程中SOCS3分子的表達情況，以及JAK2-STAT3-SOCS3信號通路在疾病發病過程中的作用未見報道。本實驗以小鼠腎毒素血清(nephrotoxic sera，NTS)性腎炎模型[4]為基礎，通過調節NTS劑量，得到可自愈的小鼠腎炎模型，以研究SOCS3分子在該病進程不同時點的表達規律和意義。

材 料 和 方 法

1動物

日本大耳兔3只，雄性，體重2.5 kg，C57BL/6小鼠40只，雌性，體重18～20 g，均由北京大學醫學部實驗動物中心提供。

2主要試劑

兔抗鼠SOCS3Ⅰ抗、兔抗鼠JAK2Ⅰ抗、兔抗鼠p-JAK2Ⅰ抗、兔抗鼠STAT3Ⅰ抗、兔抗鼠p-STAT3Ⅰ抗和HRP標記抗兔Ⅱ抗為Cell Signaling Technology產品；羊抗鼠SOCS3Ⅰ抗為Santa Cruz產品； HRP標記抗羊免疫組化檢測Ⅱ抗和DAB顯色試劑盒為北京中杉金橋生物技術有限公司產品；完全弗氏佐劑、兔IgG和NP-40為Sigma產品；苯甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)、抑肽酶(aprotinin)和亮抑酶肽(leupeptin)為Amresco產品。ECL試劑盒為Thermo產品；Masson染色試劑盒為福州邁新生物技術開發有限公司產品。

3方法

3.1小鼠NTS的制備[4]取C57BL/6小鼠腎皮質，研磨過60、80、200目細胞篩，在200目細胞篩上面收集腎小球，將腎小球勻漿后制成混懸液。取腎小球勻漿液(蛋白濃度：200 g/L)與弗氏完全佐劑1∶1混合于第1、7和21 d皮下注射免疫兔，于第50 d收集兔血清即為NTS，檢測NTS中總IgG含量。

3.2分組及造模 40只C57BL/6小鼠隨機分為2

組，每組20只，即對照組和模型組。小鼠腎炎的制備：皮下注射兔IgG(250 μg/只)和弗氏完全佐劑混合液，于第4、5和6 d分別靜脈注射給予NTS(100 μg總IgG/只)。對照組用空白兔血清取代NTS，其它處理與模型相同。分別于第10、15、20和25 d每個時點隨機選擇5只小鼠，體外壓迫膀胱法收集小鼠尿液，然后斷頭處死，摘取腎臟。

3.3小鼠尿蛋白檢測 考馬斯亮藍G250染色法檢測小鼠尿蛋白含量。

3.4腎組織病理檢測 取小鼠腎臟于液氮冷凍30 s后用OTC包埋，冰凍切片機切片，片厚6 μm。HE染色，Masson染色(步驟參照試劑盒說明書)，觀察腎組織病理變化。

3.5腎組織兔抗小鼠腎小球抗體沉積檢測 用HRP標記的抗兔抗體孵育，DAB顯色，觀察兔抗鼠腎小球基底膜抗體沉積情況。

3.6腎臟JAK2-STAT3-SOCS3信號通路相關蛋白檢測

3.6.1免疫組化方法檢測腎臟冰凍切片SOCS3的表達 兩步法檢測：取腎組織冰凍切片，丙酮固定后，37 ℃烤片3 h，3%過氧化氫孵育10 min，BSA封閉1 h，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，用Image-Pro Plus軟件半定量分析。

3.6.2Western blotting檢測小鼠腎臟SOCS3表達和JAK2、STAT3磷酸化 組織蛋白提取：腎臟組織100 mg加入500 mL蛋白裂解液中，勻漿器勻漿，12 000×g4 ℃離心20 min取上清，考馬斯亮藍G250染色法檢測蛋白含量，分裝后-80 ℃凍存。取蛋白，用裂解液調蛋白濃度至每組相等，加入5×loading buffer， 沸水煮6 min。取蛋白60 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，后轉至PVDF膜上，BSA封閉1 h，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，用增強化學發光法(enhanced chemiluminescence，ECL)檢測，Bio-Rad軟件半定量分析。

4統計學處理

結 果

1NTS腎炎模型病程中尿蛋白水平變化

與對照組比較，第15、20和25 d模型組蛋白尿水平均明顯升高(P<0.01)，提示腎臟功能在第15 d即有損傷，見圖1。

圖1制備模型后不同時點小鼠尿蛋白水平的變化

2NTS腎炎模型病程中腎組織病理改變

HE染色結果顯示，對照組小鼠腎小球囊間隙清楚，腎小管排列規則。模型組第10 d小鼠腎組織有炎癥細胞浸潤，但炎癥損傷和間質水腫均不明顯，在第15和20 d可以看到大量的炎癥細胞浸潤，腎間質嚴重水腫，腎小囊與周圍組織粘黏，部分腎小球萎縮，部分腎小球因代償作用而增大。第25 d可以看到間質水腫降低，腎小球周圍炎癥細胞浸潤減少，炎癥似進入恢復期，見圖2。

Masson染色結果顯示，不同時點的模型組比對照組腎小球周圍纖維增多不明顯，在第20和25 d中腎小球出現部分硬化,說明本次炎癥損傷以間質水腫為主，腎小球硬化主要為局部硬化，纖維化不明顯，見圖3。

Figure 2. HE staining of mouse kidney tissues. A: control group； B:model group (day 10)； C: model group (day 15)； D: model group (day 20)； E: model group (day 25).

圖2小鼠腎組織HE染色

Figure 3. Masson staining of mouse kidney tissues. A: control group； B:model group (day 10)； C: model group (day 15)； D: mo-del group (day 20)； E: model group (day 25).

圖3小鼠腎組織Masson染色

3NTS腎炎模型病程中兔抗小鼠腎小球基底膜抗體沉積情況

模型組第10 d開始便呈現抗腎小球基底膜抗體明顯沉積，并且在腎炎過程中沉積情況類似，模型組第10、15、20和25 d各時點沉積情況無明顯差別，見圖4。

4NTS腎炎模型病程中JAK2-STAT3-SOCS3信號通路相關蛋白表達

4.1免疫組化結果顯示，腎臟組織SOCS3蛋白免疫組化染色表現棕色部分逐漸增多，第25 d最為明顯，如圖5。

4.2Western blotting 結果表明，腎炎開始階段第10和15 d，JAK2/STAT3磷酸化明顯升高(P<0.01)，但此時SOCS3的升高無統計學意義(P>0.05)。腎

炎轉歸期(第25 d)，SOCS3表達顯著增多(P<0.01)，見圖6。

Figure 4. The glomerular deposits of rabbit immunoglobulin with immunohistochemical staining. A: control group； B:model group (day 15).

圖4免疫組化染色檢測小鼠腎小球兔免疫球蛋白沉積

圖5免疫組化染色檢測腎組織SOCS3表達

圖6Westernblotting檢測腎組織SOCS3表達以及JAK2/STAT3磷酸化情況

討 論

免疫性腎炎病程漫長，發病機制與自身免疫系統對腎組織損傷相關。目前常用的自發性免疫性腎炎動物模型如BXSB、MRL/lpr小鼠等，這些腎炎模型隨小鼠月齡增加日益嚴重，最終死亡，沒有出現腎炎轉歸，愈合。而人類腎炎疾病多數是發病在一定期間內愈合。NTS鼠腎炎模型是通過靜脈注入含有抗鼠腎小球基底膜抗體的腎毒素血清，通過抗原抗體反應而誘導的自身免疫系統損傷腎臟組織，而誘發的腎炎模型，病因清楚，條件可控。本實驗通過調節NTS的劑量而制備出可以在一定時間內自愈的腎炎模型。本實驗模型在第10 d沒有出現明顯腎炎損傷，而在第15和20 d時出現顯著腎臟病理改變，并且炎癥損傷在第25 d時有消退趨勢，模擬了可自愈的免疫性腎炎的過程，因而可以觀察在整個腎炎發病過程中目標蛋白的表達情況。本模型由于時間較短，腎炎的損傷以急性損傷為主，主要表現為間質水腫，腎小球與周圍組織黏連，部分腎小球萎縮、硬化,纖維化不是很明顯。本實驗中JAK2/STAT3在腎炎的發展過程中出現隨炎癥程度增高而激活增加的趨勢。SOCS3并沒有表現出此趨勢，而在炎癥損傷最為嚴重的第20 d表達增加，并在炎癥開始消退的第25 d顯著增加。此實驗結果提示我們SOCS3在腎炎愈合期發揮重要作用，這也說明免疫性腎炎自我恢復是有自身信號轉導負調控參與的，而且負調控的啟動可能與炎癥的發生有時間差，或者達炎癥刺激閾值才能誘導有效地負調控應答反應。本實驗免疫組化結果表明SOCS3在第15 d表達增加也有統計學意義，但Western blotting檢測沒有統一的結果，說明可能是SOCS3在第15 d也有局部增高現象，但對于整個腎臟來說增高不是很明顯，SOCS3的表達可能由于局部炎癥差異而出現表達變化。

目前腎炎的主要治療方法是抗感染、利尿、抑制免疫[5]、阻斷特異免疫細胞功能[6]、嚴重者進行透析等。研究[7]已發現JAK/STAT 信號通路與腎炎有重要關系，并且通過AG490阻斷可以緩解癥狀，延長模型鼠壽命。本實驗提示我們，提高腎組織SOCS3的表達，可能為治療腎炎的有效方法。如果找到可以提高腎組織SOCS3的藥物，可有效縮短腎炎過程，促使該疾病早日康復。在其它的免疫類疾病中如風濕性關節炎、免疫性肝炎，外源性補充SOCS3表現出良好治療作用[3, 8]。這提示我們外源性補充 SOCS3可能也是治愈腎炎的有效手段。JAK-STAT信號通路在糖尿病腎病中高糖誘導的腎小管上皮細胞轉化也發揮重要作用[9]，作為負調控蛋白SOCS3對于糖尿病腎病可能也會有治療作用。

[1] Alexander WS, Hilton DJ. The role of suppressors of cytokine signaling (SOCS) proteins in regulation of the immune response[J]. Annu Rev Immunol, 2004,22(1):503-529.

[2] Qin H,Niyongere SA, Lee SJ, et al. Expression and functional significance of SOCS-1 and SOCS-3 in astrocytes[J]. J Immunol, 2008,181(5):3167-3176.

[3] Jo D, Liu D, Yao S, et al. Intracellular protein therapy with SOCS3 inhibits inflammation and apoptosis[J]. Nat Med, 2005,11(8):892-898.

[4] Xie C, Rahman ZS, Xie S, et al. Strain distribution pattern of immune nephritis: a follow-up study[J]. Int Immunol, 2008,20(6):719-728.

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Expressionofsuppressorofcytokinesignaling3duringthecourseofmousenephritis

XU Wen-pin, SHEN Nan, ZHANG Er-juan, LI Min, LI Wei-dong

(DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100191,China.E-mail:lwdpharma@126.com)

AIM: To explore the expression and role of suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) in mouse nephritis.METHODSC57BL/6 mice were challenged with rabbit anti-mouse glomerular basement membrane nephrotoxic sera (NTS) to induce immune nephritis. On days 10, 15, 20 and 25, the urine samples from the mice were collected, and the kidneys were also harvested. The degree of proteinuria and the changes of renal pathology were detected to assess the course of nephritis. The expression of SOCS3 and the phosphorylation of Janus kinase 2 (JAK2) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in the kidney were determined by Western blotting and immunohistochemical method.RESULTSIn model group, the severity of pathological changes increased over time by determining the proteinuria levels and observing the kidney pathological sections. However, the nephritis was improved on day 25. The expression level of SOCS3 did not change with the phosphorylation of JAK2/STAT3 immediately, but became increased when the disease was severer and got to a significantly higher level in convalescence.CONCLUSIONThe expression level of SOCS3 does not increase immediately after the remarkable phosphorylation of JAK2/STAT3, and the protective effect of SOCS3 in nephritis might occur in convalescence.

Suppressor of cytokine signaling; Nephrotoxic sera; Negative regulation; Signaling pathways

R364.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.025