LY367385通過抑制細胞外信號調節激酶途徑減輕小鼠腦血管痙攣后神經細胞凋亡*

李 冉， 劉 江， 崔建忠， 王海濤， 田艷霞， 王凱杰， 張宇新， 高俊玲△

(1河北聯合大學基礎醫學院，2唐山市工人醫院，河北 唐山 063000)

1000-4718(2012)07-1275-06

2011-12-22

2012-02-29

河北省自然科學基金資助項目(No. C2009001247)；河北省教育廳重點課題(No. ZH200803)；

衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室開放課題 (No. ZDS200801)；河北省衛生廳醫學科學研究重點計劃指令項目(No.20110164)

△通訊作者 Tel: 0315-3725754; E-mail: junlinggao@163.com

LY367385通過抑制細胞外信號調節激酶途徑減輕小鼠腦血管痙攣后神經細胞凋亡*

李 冉1， 劉 江1， 崔建忠2， 王海濤1， 田艷霞1， 王凱杰2， 張宇新1， 高俊玲1△

(1河北聯合大學基礎醫學院，2唐山市工人醫院，河北 唐山 063000)

目的探討代謝型谷氨酸受體1(mGluR1)選擇性拮抗劑LY367385對腦血管痙攣(CVS)后神經細胞凋亡的影響及細胞外信號調節激酶1/2(ERKl/2)途徑的作用。方法采用非開顱血管內線栓法制備小鼠蛛網膜下腔出血(SAH)并CVS模型，隨機分為3組：假手術組、模型對照組和mGluR1拮抗劑LY367385組，于SAH后10 min側腦室注射生理鹽水或LY367385(500 nmol)5 μL，術后行神經功能評分。分別在SAH后6、24和48 h 3個時點取右側腦組織標本，在光鏡和電鏡下觀察腦組織病理變化，采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測各組mGluR1 mRNA的表達變化；蛋白免疫印跡法檢測mGluR1和p-ERK1/2蛋白的表達；用TUNEL法檢測神經細胞凋亡情況。結果與假手術組比較，模型組小鼠神經功能評分顯著降低，隨CVS時間延長，各組小鼠mGluR1 mRNA、mGluR1和p-ERK1/2蛋白均有不同程度增強，凋亡細胞增多，神經細胞出現變性壞死、神經軸索變性斷裂。與模型組比較，拮抗劑組小鼠神經功能評分增加，mGluR1 mRNA、mGluR1和p-ERK1/2蛋白表達均有不同程度下調，神經細胞凋亡數目減少，腦組織形態學和超微結構損傷減輕。結論(1)CVS后mGluR1的表達增強可通過激活ERK信號途徑誘導神經細胞凋亡。(2)mGluR1選擇性拮抗劑LY367385對CVS損傷具有拮抗作用。

腦血管痙攣； 受體，代謝型谷氨酸； 細胞外信號調節激酶； 小鼠

腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)是蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)后最嚴重的并發癥，嚴重影響患者的預后[1]，其確切發病機制不詳，目前臨床上尚未有藥物可以有效治療[2]。細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK) 信號途徑是SAH后重要的信號轉導通路。有證據表明，在大鼠腦缺血模型中，磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的表達在腦動脈阻塞后1～4 h即增高[3]，而且ERKl和ERK2的磷酸化可能與該區域神經細胞的生存密切相關。在閉合性腦創傷后p-ERK1/2陽性細胞和TUNEL陽性細胞存在共定位，應用ERK抑制劑U0126預處理可減少腦創傷后14 d腦部的損傷面積[4]，提示ERK1/2可能在腦損傷過程中起重要作用，研究ERK1/2表達調控機制，對揭示腦損傷發病機制并尋找針對性防治藥物有重要意義。近來有研究表明代謝型谷氨酸受體1 (metabotropic glutamate receptor 1，mGluR1)的激活能夠誘導包括ERK1/2在內的多種激酶的活性[5]，類似機制是否存在于CVS模型神經元凋亡過程仍不清楚。本研究應用SAH并CVS模型小鼠，觀察mGluR1的選擇性拮抗劑LY367385對腦海馬區細胞凋亡及ERK1/2活化的影響，以期為尋找CVS有效的防治策略提供線索。

材 料 和 方 法

1主要試劑

mGluR1兔抗鼠單克隆抗體購自Labvision，p-ERK1/2兔抗鼠單克隆抗體購自Cell Signalling，mGluR1選擇性拮抗劑LY367385購自Tocris，β-actin兔抗鼠單克隆抗體購自Sigma，原位末端缺刻標記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)試劑盒購自Roche。

2動物與分組

清潔級雄性ICR小鼠(北京維通利華動物中心)96只,批號為SCXK(京)2002-2003，體質量28～32 g，隨機分為假手術組(sham組)20只、模型組[SAH+生理鹽水(NS)組]38只和mGluR1的選擇性拮抗劑LY367385干預組(SAH+LY367385組)38只。

3主要方法

3.1動物模型的建立與給藥方法 麻醉消毒后，于手術顯微鏡下自小鼠右側頸外動脈(arteria carotis externa, ECA)經頸內動脈(arteria carotis interna, ICA)導入5-0單纖維尼龍線，至大腦前動脈(anterior cerebral artery, ACA)與大腦中動脈(arteria cerebri media, MCA)分叉處，刺破動脈壁，總進入長度約為(10.0±0.5)mm。假手術對照組將尼龍線只送至MCA與ACA分叉處，稍感阻力即停止繼續插入，并迅速退出尼龍線，結扎頸外動脈的斷端，縫合皮膚，單籠飼養。利用腦立體定位儀于SAH后10 min用微量注射器向右側腦室內緩慢注射mGluR1的選擇性拮抗劑LY367385 5 μL，5 min注射完，留針10 min，再緩慢拔出微量注射器，NS組在相同時相僅注射等量的NS。

3.2神經功能評分 參照本課題組文獻報道[6]方法并改進，每天1次。神經功能評分的總分為3～21分，其中運動功能0～12分，見表1，感覺功能3～9分，見表2。

3.3痙攣腦血管MCA病理改變病理檢測 各組動物麻醉開胸，70 mmHg壓力下經左心室灌注等滲鹽水至流出液體清亮，4%多聚甲醛PBS(pH 7.2～7.4)緩沖液100 mL灌注，斷頭取腦，取大腦中動脈至大腦前動脈分叉處前后3 mm范圍的腦組織冠狀切開，入4%多聚甲醛后固定室溫2 h，入4 ℃ 20%蔗糖磷酸鹽緩沖液，應用恒冷箱切片機連續冠狀切片，片厚20 μm。切片行HE染色，光鏡下觀察痙攣腦血管MCA病理改變。

3.4海馬組織總RNA提取和RT-PCR檢測 麻醉后斷頭取腦，分離海馬，利用Trizol試劑提取總RNA。按照RNA擴增試劑盒說明書進行逆轉錄和PCR擴增。引物由上海生工生物工程技術公司合成，序列見表3。反轉錄反應條件為：42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min 5 ℃ 5 min。采用β-actin為內參照(各引物序列見表2)。β-actin PCR擴增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s；52 ℃ 30 s；72 ℃ 2.5 min，共30個循環，72 ℃ 10 min。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用GIS凝膠成像系統進行積分吸光度(IA)分析, 以目的條帶與內參照β-actin的IA比值表示相對表達水平。

表1 神經運動功能評分

表2 神經感覺功能評分

表3 引物序列

3.5蛋白免疫印跡法(Western biotting)檢測mGluR1和p-ERK1/2表達 每組各取6只小鼠，斷頭取腦后冰上快速分離右側海馬，加入全細胞裂解液0.6 mL勻漿，12 000 r/min 4 ℃離心5 min, 取上清，考馬斯亮藍G 250結合法蛋白定量。樣品制備，聚丙烯酰胺凝膠電泳轉膜，分別加入p-ERK1/2 Ⅰ抗(1∶1 000)，mGluR1(1∶800)，β-actin(1∶1 000)封閉，免疫熒光化學發光法(ECL)顯色。Bio-Rad系統進行吸光度測定，以目的條帶與內參照β-actin的平均吸光度的比值表示蛋白水平進行半定量分析。

3.6TUNEL法檢測海馬CA1區神經細胞凋亡 按原位細胞凋亡檢測試劑盒說明進行實驗步驟，DAB顯色。每個標本取4張切片，每張切片在海馬隨機選取4個視野，在400倍光鏡下應用目鏡網格測試系統，隨機計數小鼠海馬CA1區的陽性細胞數目。

3.7腦組織形態學與超微結構的觀察 各組于相應時間點麻醉動物后用多聚甲醛水溶液進行心臟灌注，取材，應用恒冷箱切片機連續冠狀切片，片厚20 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察并攝片。另取2只大鼠，麻醉后開胸、暴露心臟，戊二醛和多聚甲醛磷酸鹽緩沖液混合固定液灌注心臟，取大腦海馬組織制備常規透射電鏡標本，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染，透射電鏡下觀察腦組織超微結構。

4統計學處理

結 果

1CVS模型評價

模型組及拮抗劑干預組小鼠顱底均有較明顯出血，血塊分布廣，累及整個Willis環，尤以MCA和ACA分叉處及ICA周圍血塊密度大；假手術組無出血，符合CVS模型制備要求。

2神經功能評分檢測結果

SAH術后小鼠精神狀態差，難進食水。術側對側的面部觸覺、胡須觸覺與耳后皮膚觸覺等局部感覺受損；攀爬能力、平衡能力與本體感覺等均下降。雙前肢伸直不對稱，提尾令其前行時向左側傾斜，17%小鼠出現左旋現象，符合CVS研究的要求。假手術組小鼠肌力正常，未出現神經功能缺損體征，神經功能評分為24分。與假手術組比較，模型組小鼠神經功能評分均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，拮抗劑干預組24 h和48 h小鼠神經功能評分好轉，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1各組小鼠神經功能評分

3腦血管痙攣MCA形態改變

假手術組MCA管腔光滑，內皮細胞排列平整；術后模型組MCA產生嚴重痙攣，管腔明顯狹窄，管壁顯著增厚，內彈性膜呈折扇樣彎曲，平滑肌細胞收縮，外膜炎性細胞侵潤；治療組MCA痙攣程度緩解，內彈性膜基本平坦，血管壁增厚及管腔狹窄程度亦明顯改善。

4RT-PCR檢測mGluR1mRNA

假手術組mGluR1 mRNA有少量表達。模型組術后6、24和48 h mGluR1 mRNA呈不同程度增高(0.25±0.02，0.39±0.01和0.14±0.02，均P<0.05)。與模型組比較，拮抗劑組各時點mGluR1 mRNA均不同程度減少，差異有統計學意義(0.16±0.01、0.23±0.01、0.09±0.02，均P<0.05)。

5Westernblotting檢測海馬區mGluR1和p-ERK1/2的表達

與RT-PCR檢測結果一致，假手術組mGluR1蛋白有少量表達，造模后6 h mGluR1明顯升高(P<0.05)，24 h達高峰，以后呈下降趨勢，至48 h時仍高于基礎表達。與模型組比較，拮抗劑組各時點mGluR1均不同程度減少，差異有統計學意義(均P<0.05)，見圖2。

假手術組p-ERK1/2蛋白有少量表達，模型組p-ERK1/2水平于傷后6、24和48 h較假手術組顯著增高，差異有統計學意義(均P<0.05)；拮抗劑可顯著降低6、24和48 h p-ERK1/2水平，24 h作用最為顯著(均P<0.05)，見圖3。

6TUNEL法檢測結果

凋亡神經細胞表現胞質濃縮，染色質凝集，核深染，呈深棕色顆粒狀。造模后6～48 h海馬CA1區可見TUNEL陽性細胞遞增，差異均有統計學意義(均P<0.05)；拮抗劑LY367385可顯著減少各時點的凋亡細胞數目(均P<0.05)，見圖4。

圖2Westernblotting檢測海馬區mGluR1蛋白水平變化

Figure 3. p-ERK1/2 protein expression in the hippocampus detected by Western blotting.*P<0.05vssham group;▲P<0.05vsSAH+NS group.

圖3Westernblotting檢測海馬區p-ERK1/2蛋白水平變化

圖4TUNEL法檢測海馬區凋亡細胞數目

7腦組織形態學變化

假手術組神經元結構完整，核膜清晰，胞質豐富。模型組海馬區可見散在變性、壞死的神經元，神經細胞胞體收縮呈三角形，胞質嗜色性減弱，核皺縮濃染，細胞周圍出現空隙；視野內可見核溶解及神經元細胞空泡樣變，神經元存活數目明顯減少。拮抗劑LY367385不同程度減輕神經元損傷，神經元數量有所恢復，結構有所改善，見圖5。

Figure 5. Neuronal changes in different groups 48 h after CVS(HE staining, ×400).A: sham group;B:SAH+NS group; C:SAH+LY367385 group.

圖5CVS48h各組小鼠神經元形態的變化

8腦組織超微結構變化

假手術組神經細胞核膜結構完整，邊界清晰，核內染色質分布均勻；尼氏體和線粒體等細胞器數量豐富，形態規則，結構完整。模型組可見核膜結構崩解，核內染色質邊集或片狀聚集，尼氏體和線粒體等細胞器數量顯著減少，線粒體嵴消失，呈現早期凋亡形態。拮抗劑LY367385可不同程度減輕細胞器損傷，線粒體、微管、高爾基復合體等結構較模型組改善，見圖6。

Figure 6. The ultrastructure of hippocampal CA1 neurons in the three groups (×20 000). A: sham group;B:SAH+NS group; C:SAH+LY367385 group.

圖6CVS48h各組小鼠海馬CA1區神經元超微結構的變化

討 論

mGluRs是一種重要的中樞神經系統興奮性氨基酸受體，在腦內分布廣泛，與相應的配體結合后主要產生興奮作用。根據其氨基酸序列的同源性及藥理性質，可分為3組：I組含mGluR1和mGluR5，II組由mGluR2和mGluR3組成，III組由mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8構成。第I組mGluRs激活后參與神經元的繼發性損傷，而第Ⅱ和第Ⅲ組mGluRs激活后則會產生神經保護作用[7]。mGluR1不但在記憶、學習和突觸傳遞效率的可塑性變化等生理過程中起著重要作用，還與多種神經精神疾病的發病機理密切相關。有研究證實該受體的激活與MAPK通路介導的細胞生長與凋亡相關[8]，其活化能夠誘導包括ERK1/2在內的多種激酶的活性。ERK1/2在CVS病理狀態下的啟動機制尚未明確，我們推測，mGluR1可能通過調控ERK1/2信號通路而對神經細胞的存活發揮了作用。為此，本實驗設計采用mGluR1選擇性拮抗劑LY367385加以干預，動態觀測其對ERK1/2和神經細胞凋亡的影響，闡述其調控機制。結果發現LY367385可明顯下調mGluR1及ERK1/2表達，減少TUNEL陽性細胞，并且改善了CVS后海馬CA1區神經細胞壞死，提示CVS后mGluR1調控神經細胞的凋亡機制與ERK1/2信號途徑相關。

ERK1/2是一種重要信號轉導蛋白，能夠將多種外界刺激經細胞質傳人細胞核，并在這一過程中調控底物蛋白或基因表達，最終調控細胞的生物學反應。本研究觀察到mGluR1在CVS初期已大量表達，24 h達高峰，在出血6～24 h同TUNEL陽性細胞的表達呈平行趨勢，至48 h仍顯著高于基礎水平，此時凋亡細胞數目明顯增多。提示，mGluR1部分影響了神經細胞的存活，其活化可能很大程度上調動了其下游相關基因從而啟動凋亡程序。mGluR1的表達高峰遠早于細胞凋亡，提示mGluR1可能是凋亡之路上游的始動因子。研究表明，mGluR1可通過磷脂酞肌醇(PI)途徑一方面激活蛋白激酶C(PKC)增強NMDA受體介導的神經毒性；另一方面可使細胞內Ca2+濃度增高，引起神經遞質釋放、誘導相關基因表達、選擇性促進神經元壞死和凋亡。Heidinger等[9]認為mGluR1可能是通過控制某些激酶活性來控制NMDA受體的酪氨酸殘基磷酸化水平，進而增加神經細胞的興奮毒性。

本實驗中SAH初期，ERK1/2快速表達，至48 h仍高于基礎水平，說明ERK表達時程明顯延長，呈現過度激活狀態，ERK1/2長時程活化的結果可能使轉錄因子的不同部位或者下游效應器被激活，促進了細胞凋亡的發生，推進SAH病理進程。研究證實，腦出血損傷后神經細胞凋亡的發生與神經功能改變具有相關性[10]，凋亡現象在CVS形成機制中起重要作用[11]，最終可能導致腦損傷后期的神經功能缺陷[12]。在兩次注血SAH模型研究中顯示，出血后基底動脈發生嚴重痙攣，基底動脈管徑數值在首次注血后3、5、7 d時分別遞減，ERK1/2表達水平在第3 d達到高峰，并持續至第7 d，ERK抑制劑PD98059可明顯降低ERK1/2的表達水平，并可顯著逆轉CVS，使SAH后7 d時血管內徑增加了26%[13]，提示p-ERK1/2在CVS進程中起了重要的作用[14]。mGluR1拮抗劑減少了mGluR1、p- ERK1/2及神經細胞凋亡，進一步證實Glu位于ERK-凋亡通路的上游，抑制mGluR1和p- ERK1/2出血后高表達，可部分阻抑神經細胞凋亡。

綜上所述，CVS模型小鼠在過量表達mGluR1的條件下，可上調ERK信號通路，影響神經細胞活性。mGluR1的選擇性拮抗劑LY367385可減少p-ERK1/2的活化，抑制細胞凋亡，減少海馬神經元損傷，具有神經保護作用。

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LY367385attenuatesneuronalapoptosisaftercerebralvasospasminmicebyinhibitingextracellularsignal-regulatedkinasepathway

LI Ran1, LIU Jiang1, CUi Jian-zhong2, WANG Hai-tao1, TIAN Yan-xia1, WANG Kai-jie2, ZHANG Yu-xin1, GAO Jun-ling1

(1SchoolofBasicMedicine,HebeiUnitedUniversity,2TangshanWorkers'Hospital,Tangshan063000,China.E-mail:junlinggao@163.com)

AIM: To investigate the effects of LY367385，a selective antagonist of metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1), on the apoptosis of neuron, and the role of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) signal pathway after cerebral vasospasm (CVS) in mice.METHODSThe model of subarachnoid hemorrhage (SAH) in mice was established by endovascular perforation without opening cranium. Male ICR mice were randomly divided into 3 groups: sham operation group, NS+SAH group and LY367385+SAH group. Ten minutes after SAH, 5 μL of LY367385 or NS was microinjected into lateral cerebral ventricle, and then the neurological scores of the animals were examined. At different time points (6 h, 24 h, 48 h) after operation, the pathological changes in the brain tissues were observed under light and electron microscopes. The mRNA expression of mGluR1 was detected using RT-PCR, and Western blotting was used to examine the protein levels of mGluR1 and p-ERK1/2. Apoptotic cell number was determined by TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) method.RESULTSIn SAH+NS group, the scores of neurological function were significantly lower, while the mGluR1 mRNA, mGluR1 and p-ERK1/2 proteins and the number of apoptotic cells were significantly higher than those in sham operation group.Some neurons displayed histopathological changes of necrosis, myelin sheath internalization and disconnection. LY367385 decreased the mRNA expression of mGluR1 and protein levels of mGluR1 and ERK1/2.The neuronal apoptosis, neurological score and the ultrastructural changes were also improved.CONCLUSIONThe increased expression of mGluR1 in hippocampus may induce apoptosis by activation of ERK1/2 signaling after CVS. LY367385 exerts good therapeutic effect on severe CVS.

Cerebral vasospasm; Receptors,metabotropic glutamate; Extracellular signal regulated kinase; Mice

R743.35

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.023