雌激素通過KATP通道影響大鼠腸系膜動脈的反應性*

張登文, 徐 林, 張傳漢, 韓愛迪, 姚文龍, 王學仁

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院麻醉學教研室，湖北 武漢 430030 )

1000-4718(2012)07-1176-05

2012-01-07

2012-03-16

教育部博士點基金新教師資助項目(No.20070487131)；湖北省衛生廳青年科技人才基金資助項目(No.QJX2008-1)

△通訊作者 Tel:027-83663173;E-mail: xrwang@mail.hust.edu.cn

▲并列第1作者

雌激素通過KATP通道影響大鼠腸系膜動脈的反應性*

張登文▲, 徐 林▲, 張傳漢, 韓愛迪, 姚文龍, 王學仁△

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院麻醉學教研室，湖北 武漢 430030 )

目的觀察雌激素對大鼠腸系膜動脈平滑肌ATP敏感性鉀離子通道 (KATP通道)mRNA表達的影響，探討KATP通道在雌激素調節大鼠腸系膜血管反應性中的作用。方法雌性SD大鼠48只，體重(100±10) g，隨機分為假手術組(sham)、卵巢切除組(Ovx)和卵巢切除后補充雌激素組(Ovx +E)。采取實時熒光定量PCR檢測大鼠腸系膜動脈中KATP通道mRNA的表達；觀察各組大鼠腸系膜動脈對去甲腎上腺素(NE)升壓效應的反應性。結果與sham組相比，Ovx組大鼠腸系膜動脈KATP通道的Kir6.1及SUR2B亞單位mRNA表達減少(P<0.05)，而Ovx+E組則表達增加(P<0.05)。與sham組相比，Ovx組大鼠的血管反應性明顯增加(P<0.05)，Ovx+E組無明顯差異。給予KATP通道阻滯劑格列本脲后，sham組和Ovx+E組的動脈反應性增加(P<0.05)，Ovx組無明顯變化(P>0.05)，此時3組間比較無明顯差異(P>0.05)。結論雌激素可能通過上調腸系膜動脈平滑肌細胞KATP通道的表達來降低動脈對去甲腎上腺素升壓效應的反應性。

雌激素； ATP敏感性鉀離子通道； 血管反應性； 去甲腎上腺素

流行病學研究發現，絕經前女性的冠心病及卒中發生率比同齡男性低，到絕經后其發病率迅速增高[1]。而冠心病及卒中主要是由高血壓和動脈硬化等導致血管功能受損的一類疾病所引起，這種血管功能損害主要表現為血管收縮功能增強、舒張功能減弱。既往研究表明，絕經后雌激素的缺乏導致血管功能發生了這一系列的變化。

ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive K+channels, KATP通道)是一種內向整流性鉀通道，廣泛分布于心肌細胞、胰島β細胞、骨骼肌細胞、血管與非血管平滑肌細胞和神經細胞等多種細胞中。血管平滑肌中KATP通道開放可以引起血管舒張，它廣泛參與了多種血管活性藥物對血管功能的調節以及休克時血管功能變化[2]。然而雌激素對血管功能的影響是否有KATP通道參與目前尚不清楚。 因此，本研究采用卵巢去勢及雌激素干預模型，real-time RT-PCR技術檢測大鼠腸系膜動脈平滑肌中KATP通道表達的變化，觀察KATP通道阻滯劑對大鼠去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)升壓效應的影響。

材 料 和 方 法

1動物

雌性SD大鼠48只，體重(100±10) g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部提供，隨機分為3組，假手術組(sham)、卵巢切除組(ovariectomy，Ovx)和卵巢切除后補充雌激素組(ovariectomy+estrogen， Ovx+E)。

2試劑及儀器

Trizol試劑(TaKaRa),實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa),StepOne Real-time PCR儀(ABI)，紫外分光光度計(Eppendorf)，Biometra 96 PCR儀(Biometra)，17β-雌二醇(Sigma)，格列本脲(Sigma)，iWorx 214電生理記錄儀(iWorx)，重酒石酸去甲腎上腺素(武漢遠大制藥公司)，麻油(Sigma)。

3方法

3.1動物模型的建立 10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，取側臥位固定，以最后肋骨稍后方為中心備皮、消毒。自腰椎沿背部正中線向下做縱行切口約1～2 cm，切開皮膚，離脊柱約1 cm并沿肩胛線分別于左右兩肋下剪開腰肌，切口長約1 cm，立即見位于兩側腎臟外下方呈淡粉紅色的卵巢及緊密相連的子宮角，輕輕夾住脂肪組織將其拉出體外。在子宮角上部及下部的輸卵管部位做2個結扎，結扎后剪斷子宮角，將卵巢摘除。把脂肪組織推回腹腔內，將腹膜與肌層一起縫1針，檢查有無出血，縫合皮膚。術后常規腹腔注射抗生素3 d，并連續陰道涂片，Ovx組及Ovx+E組陰道上皮無動情周期變化提示去勢完全。

3.2藥物干預 于去勢后第4周Ovx+E組每天皮下注射100 μL溶有17β-雌二醇(10 μg/kg)的麻油，Ovx組及sham組每天皮下注射等體積麻油，連續給藥2周后，每組各取4只大鼠，10%水合氯醛麻醉后處死，提取腸系膜動脈組織。

3.3子宮指數的測定及HE染色 所有大鼠處死前稱取體重，處死后剪取子宮，電子分析天平稱取子宮濕重，計算子宮指數(子宮濕重/大鼠體重)。然后進行冰凍切片，行HE染色。

3.4Real-time RT-PCR 檢測KATP通道mRNA的表達 用Trizol試劑盒提取各組大鼠腸系膜動脈RNA，紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度，按實時定量RT-PCR試劑盒說明書將總RNA逆轉錄成cDNA，然后在ABI StepOne Real-time PCR儀上進行PCR反應。PCR引物序列見表1，其反應條件為：95 ℃預變性 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個循環。分析熔解曲線，根據熔解曲線判斷是否存在非特異性擴增。以2-ΔΔCt的方法分析 mRNA的相對表達變化，ΔΔCt=[Ct(目的基因)-Ct(內參照基因)]處理組-[Ct(目的基因)-Ct(內參照基因)]對照組[3-4]。

表1 Real time PCR引物序列

3.5血管反應性 通過給予NE后平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)的變化觀察動脈血管的反應性[5]。大鼠吸入異氟烷麻醉后，通過頸總動脈插管連接壓力換能器監測動脈血壓，通過頸靜脈插管開放靜脈通道。手術完成后，平衡血壓30 min，通過靜脈插管推注NE 3 μg/kg，記錄注射NE 前后大鼠MAP值，NE作用后MAP變化值反映整體血管反應性。格列本脲溶于0.01 mol/L NaOH溶液中，靜脈插管緩慢注射4 g/L格列本脲(1 mg/kg)，5 min后重復上述實驗，給予3 μg/kg NE[6]。

4統計學處理

結 果

1子宮HE染色

Sham組和Ovx+E組大鼠的子宮外觀質地飽滿、色澤粉紅，而Ovx組大鼠子宮質地細薄、色澤較白。與sham組相比較，Ovx+E組大鼠子宮指數差異無統計學意義(P>0.05)，而Ovx組大鼠子宮指數顯著降低(P<0.05)，見表2。HE染色可以看出Ovx組大鼠子宮肌層及內膜萎縮，體積明顯減小，腺體減少散在、腔隙變窄，sham組及Ovx+E組子宮內膜及肌層明顯增厚，腺體數量增加、腔隙增大，見圖1。

2腸系膜動脈中KATP通道mRNA的表達

與sham組相比，Ovx 組大鼠腸系膜動脈KATP通道的Kir6.1亞單位mRNA表達減少(P<0.05)，而Ovx+E組SUR2B亞單位mRNA表達增加(P<0.05)。與Ovx組比較，Ovx+E組Kir6.1和SUR2B亞單位mRNA表達增加(P<0.05)，見圖2。

表23組子宮指數的比較

GroupUterineindexSham1.947±0.270Ovx0.285±0.040*Ovx+E1.684±0.600#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsOvx group.

Figure 1. Histological changes of the rat uteri in different groups (HE staining). A，B，C:×40；D，E，F:×100.

圖1各組大鼠子宮的組織學變化

圖2大鼠腸系膜動脈KATP通道亞單位Kir6.1和SUR2BmRNA的表達

3血管反應性

與sham組相比，Ovx組大鼠在NE作用下的MAP增幅明顯升高(P<0.05)，而Ovx+E組無明顯變化。與Ovx組相比，Ovx+E組NE引起的MAP增幅顯著降低(P<0.05)。給予KATP通道阻滯劑格列本脲后，sham組和Ovx+E組對NE的反應性增加(P<0.05)，此時3組之間NE引起的MAP增幅無明顯差別(P>0.05)，見圖3。

圖3NE誘導的升壓反應

討 論

本研究結果顯示，雌激素可以增加腸系膜動脈血管平滑肌細胞KATP通道mRNA的表達；卵巢去勢后大鼠對NE的升壓作用反應性增加，補充雌激素后則可以抑制此作用。

本實驗首先通過陰道涂片觀察大鼠的動情周期，判斷卵巢去勢模型的建立是否成功。在確定卵巢去勢成功后，再分別補充雌激素。補充雌激素后的大鼠子宮指數與假手術組相比無明顯差異，但比去勢組明顯升高，同時HE染色可以看到Ovx組大鼠子宮肌層及內膜萎縮，體積明顯減小，腺體減少散在、腔隙變窄，sham組及Ovx+E組子宮內膜及肌層明顯增厚，腺體數量增加、腔隙增大，這說明卵巢去勢模型建立成功及雌激素干預有效。

如前所述，冠心病及卒中主要是由高血壓和動脈硬化等可以導致血管功能受損的一類疾病所引起，而這種血管功能損害主要表現為血管收縮功能增強、舒張功能減弱。因此，本實驗選擇靜脈注射NE引起的升壓效應來反映動脈血管的收縮功能。結果顯示，卵巢去勢后大鼠對NE升壓效應的反應性明顯增加，血管反應性增加；而卵巢去勢后又重新補充雌激素，大鼠血管反應性與假手術組大鼠相比則沒有明顯差異。由此可以說明，卵巢去勢后導致雌激素缺乏，使得血管收縮功能增強，反應性增高，補充雌激素可以降低血管對NE的反應性。流行病學研究顯示，絕經后的女性高血壓的發病率明顯高于絕經前女性。其它研究也提示，雌激素可以通過調控血管活性物質如前列環素、一氧化氮、血漿內皮素的生成與分泌，抑制血管的收縮，從而使血管擴張[7-8]。

KATP通道是一種內向整流性鉀通道，其開放主要受細胞內ATP水平的調控，在ATP濃度降低或缺氧時其開放率明顯增加，從而將各種興奮性組織中細胞的電活動與胞質的代謝狀態相偶聯[9]。KATP通道在廣泛分布與心肌細胞、胰島β細胞、骨骼肌細胞、血管與非血管平滑肌細胞和神經細胞等多種細胞中。血管平滑肌細胞KATP通道由Kir6.1和SUR2B亞單位構成，此通道開放，K+外流增加，細胞超級化，接著引起電壓門控Ca2+通道關閉增加并降低Ca2+內流，細胞內Ca2+濃度的降低引起血管平滑肌細胞收縮功能的降低和反應性降低[10]。可見KATP通道對動脈平滑肌細胞的膜電位和動脈血管張力起重要的調節作用[2, 11]。它廣泛參與了多種血管活性藥物對血管功能的調節如腺苷、β受體激動劑，以及休克時血管功能變化[12]。在內毒素性休克時，血管反應性明顯降低，而在給予一定量的KATP通道的阻滯劑格列本脲后，可以增強血管對NE的反應性。Shi等[13]的研究發現脂多糖可以增加血管平滑肌KATP通道的表達，這進一步說明了KATP通道對血管反應性起著重要的作用。我們推測KATP通道可能參與了雌激素降低血管對NE反應性的過程。

本研究采用實時熒光定量PCR檢測雌激素是否影響了腸系膜動脈血管平滑肌細胞KATP通道表達。腸系膜動脈床面積大，在維持外周阻力中具有重要作用，因此本實驗取材于腸系膜動脈。而實驗結果顯示卵巢去勢組大鼠腸系膜動脈組織中KATP通道各亞單位mRNA表達較假手術組明顯降低，而補充雌激素后KATP通道表達又明顯升高。這說明雌激素可以上調腸系膜血管平滑肌KATP通道的表達。其它研究也發現類似雌激素上調KATP通道的現象：Huang等[14]研究發現，雌激素作用于下丘腦POA區通過上調KATP通道來發揮對GnRH釋放峰的負反饋作用。Ranki等[15]研究結果顯示，雌激素可以上調心臟組織KATP通道表達，從而增加心肌細胞對代謝應激的耐受力。Park等[16]發現暴露在雌激素下的子宮平滑肌KATP通道的表達增加，可能導致子宮平滑肌瘤細胞的增殖。同時，我們實驗結果顯示，給予KATP通道阻滯劑格列本脲后，NE引起的升壓作用在sham組、Ovx組及Ovx+E組之間無明顯差別。這進一步證實了KATP通道可能參與雌激素減低血管對NE的反應性。

總之，本研究表明雌激素可能通過上調腸系膜動脈平滑肌細胞KATP通道的表達來降低血管對縮血管物質刺激的反應性。這可能是雌激素對心血管保護作用的另一種潛在機制，也可能是絕經后女性冠心病及卒中發生率發病率迅速增高的原因之一。

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EstrogenaffectsreactivityofratmesentericarterythroughATP-sensitivepotassiumchannel

ZHANG Deng-wen, XU Lin, ZHANG Chuan-han, HAN Ai-di, YAO Wen-long, WANG Xue-ren

(DepartmentofAnesthesiology,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:xrwang@mail.hust.edu.cn)

AIM: To observe the expression of ATP-sensitive potassium (KATP) channel mRNA in mesenteric artery smooth muscle of rats with estrogen administration, and to evaluate the role of KATPchannel in the effects of estrogen on the reactivity of mesenteric artery in rats.METHODSForty-eight female Sprague-Dawley rats, weighing (100±10) g, were randomly divided into 3 groups: sham operation (sham) group, ovariectomy (Ovx) group and ovariectomy with estrogen administration (Ovx+E) group. The mRNA expression of KATPsubunits in mesenteric artery smooth muscle was detected by quantitative real-time PCR. Artery reactivity in the rats was observed by norepinephrine-induced pressor response.RESULTSCompared with sham group, the mRNA expression of Kir6.1 and SUR2B was significantly decreased in Ovx group (P<0.05), but increased in Ovx+E group (P<0.05). Compared with sham group and Ovx+E group, the pressor response induced by norepinephrine in the rats were enhanced in Ovx group (P<0.05). No significant difference between sham group and Ovx+E group was observed. After administered with glibenclamide (a KATPchannel blocker), the pressor response induced by norepinephrine was enhanced in sham group and Ovx +E group, and no changes in Ovx group. Meanwhile, no difference among the 3 groups was found.CONCLUSIONEstrogen up-regulates the expression of KATPchannel subunits, which may be involved in estrogen-reduced pressor response to norepinephrine.

Estrogen; ATP-sensitive potassium channels; Vascular reactivity; Norepinephrine

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.005