聯合應用siRNA抑制HBVcccDNA的實驗研究

李靜紅，武立剛，周亞丹，崔 穎，李桂秋

（1.齊齊哈爾醫學院附屬三院，黑龍江 齊齊哈爾161000；2.哈爾濱醫科大學第一臨床醫學院 微生物科）

RNA干擾是細胞利用21－23nt雙鏈RNA介導的轉錄后同源m RNA沉默的現象［1］。由于具有高度特異性和有效性，RNA干擾被廣泛用于HIV、HCV、流感病毒等功能性基因的研究中。基于逆轉錄環節在HBV復制中的重要作用，一些學者已經證實RNA干擾可以通過沉默病毒基因來抑制HBV復制［2，3］，這為抗 HBV 慢性感染提供了一種新的方法。我們曾經報道過針對HBV核定位信號區的小干擾RNA（siRNA）能夠有效抑制 HBV DNA復制和ccc DNA擴增［4］。因為 HBV感染是多基因參與的細胞內感染過程，我們認為聯合使用siRNA能夠發揮更強的抗HBV作用。在本實驗中，我們在Hep G2.2.15細胞中聯合應用siRNA來抑制HBV復制。實驗結果表明聯合應用siRNA比單獨應用siRNA產生更強烈的抑制HBV復制作用，特別是對cccDNA的抑制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 （DMEM）和G418購自美國GIBCO公司。Hep G2.2.15細胞為本實驗室保存。質粒psi／U6由武漢晶賽公司提供。PCR引物由上海博雅 生物公司合成。Trizol，M－MLV 逆轉錄酶，Lipofection 2000購自美國Invitrogen公司。所用限制性內切酶購自NEB公司。

1.2 構建質粒表達載體 我們在質粒psil／U6的Bam HⅠ－HindⅢ位點之間插入一段21nt的編碼相應siRNA的特異序列構建了HBVsiRNA的表達載體，并進一步通過BLAST分析為未發現同源序列。引物序列如下：siRNA1：5’－AAGATCTCAATCTCGGGAATC－3’；siRNA2：5’－CAGGTCCCCTAGAAGAAGAAC－3’；無關對照質粒HK：5’－ACTACCGTTGTTATAGGTG－3’。重組質粒通過酶切和DNA序列分析加以鑒定。

1.3 細胞培養和轉染 Hep G2 2.2.15細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中（含青霉素100 U／ml，鏈霉素100μg／ml，200μg／ml G418），37℃ ，體積分數為5%CO2的孵箱中培養。轉染前24小時將細胞置于6孔板培養，4μg表達相應siRNA的質粒與脂質體Lipofectamine 2000按說明書步驟共轉染，每24小時更換培養液，分別于48、72、96小時收集細胞做進一步分析，實驗分為5組，每組設3個復孔。

1.4 檢測 用ELISA方法測定48、72、96小時細胞培養上清中HBs Ag and HBeAg的表達，按說明書進行。

1.5 HBV mRNA的檢測 分別于48、72、96小時用Trizol法從細胞中提取RNA，用M－MLV逆轉錄酶進行逆轉錄反應。PCR循環參數如下：先在94℃變性3 min，然后按下述條件循環30次，變性94℃15 s、退火52℃30 s、延伸72℃30 s，最后72℃延伸10 min結束反應。PCR引物如下：HBV上鏈引物：5’－ACCTCTGCCTAATCATCTC－3’下鏈引物：5’－GTAAGACAGGAAATGTGAAAC－3’；β－actin 上鏈 引 物 5′－GTCGGTGTGAACGGATTT－3′GAPDH下鏈引物5′－ACTCCACGACGTACTCAGC－3′。PCR擴增產物用1.2%的瓊脂糖進行電泳分析。

1.6 HBV DNA和cccDNA的檢測 分別于48、72、96小時從培養上清和細胞中提取HBVDNA和cccDNA進行實時定量PCR檢測，按說明書進行。

1.7 統計學方法 采用SPSS12.0軟件，統計處理以每組3個復孔測定值的表示，組間比較用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBsAg和HBeAg的抑制作用 用ELISA方法測定48、72、96小時細胞培養上清中HBe Ag和HBs Ag的表達，HBe Ag和HBs Ag的濃度。如圖1所示，在各個時段，無關對照組對 HBs Ag和HBe Ag的表達與空載體組相比無明顯差異（P＜0.05），說明RNAi作用是特異的。在各個siRNA治療組，HBs Ag和HBe Ag水平均有明顯下降，轉染96小時后聯合應用siRNA組對HBs Ag和HBe Ag的抑制率最強（83.89% ，91.07%）與單獨應用siRNA組相比均具有明顯差異（P＜0.05）。

2.2 Hep G2 2.2.15細胞中 HBV mRNA的抑制作用 HBVmRNA水平用RT－PCR來檢測，結果顯示各個siRNA治療組均能明顯降低mRNA水平，空載體組對mRNA無抑制作用。在96小時聯合應用siRNA組對mRNA的抑制率最強，幾乎檢測不到mRNA條帶，抑制效果明顯高于單獨應用組（圖2）。

圖1 siRNA對HBsAg和HBeAg表達水平的抑制

2.3 HBV DNA的抑制作用 HBV DNA和cccDNA水平用實時定量PCR來檢測，檢測范圍可以達到104－108拷貝。如圖3所示，各個siRNA治療組均能明顯降低DNA水平，空載體組對DNA無抑制作用。在96小時，聯合應用siRNA組病毒DNA拷貝數與對照組相比減少88.6%，抑制作用明顯高于單獨應用siRNA組（P＜0.05）。轉染96小時后，各個siRNA治療組cccDNA水平分別下降50.4%（siRNA1），22.31%（siRNA2），69.83%（siRNA1＋2）。可見，聯合應用siRNA組對cccDNA的抑制作用明最強，明顯高于單獨應用siRNA組（P＜0.05）。

圖3 siRNA對HBV DNA和cccDNA水平抑制

3 討論

RNA干擾技術為治療HBV感染提供了新的有效方法。據報道，單獨應用合成的siRNA治療HBV、HCV、HIV時，會引起病毒突變。為了解決這一問題，用針對病毒基因組的不同位點設計多個siRNA和選擇相對保守的區域。聯合療法可最大限度的降低病毒載量，成為治療HBV感染的新方法［5，6］。我們在 Hep G2 2.2.15細胞中檢測聯合應用siRNA的抗病毒效果，并與單獨應用siRNA進行了比較。因為HBV感染是多基因參與的細胞內感染過程，聯合使用siRNA能夠同時阻斷病毒基因的多個位點，使病毒難以修復，發揮更強的抗HBV作用。

Hep G2.2.15細胞是由頭尾相接的 HBV－DNA轉染人肝癌細胞株 Hep G2細胞而建立的，該細胞株能長期穩定地向培養上清液中分泌病毒蛋白和完整的病毒顆粒，還能產生大量的病毒復制中間體，更接近于HBV自然感染狀態。本實驗針對HBV核定位信號區的特異性siRNA被轉染入Hep G2.2.15細胞中，并對各種指標進行監測。結果顯示，HBs Ag、HBeAg、mRNA水平都受到抑制；同時，real－time PCR結果顯示，DNA和cccDNA水平也明顯下降，這種抑制作用具有高度選擇性、特異性、劑量依賴性的特點。在本實驗中，應用的各siRNA治療組均能明顯抑制HBV復制，其中聯合應用siRNA組對HBV的抑制作用最強，抑制效果明顯高于單獨應用siRNA組。

［1］Hammond S M，Bernstein E，Beach D.An RNA－directed nuclease mediates post－transcriptional gene silencing in Drosop cells［J］.Nature，2000，404：293.

［2］Wu HL，Huang LR，Huang CC，et al.RNA interference－mediated control of hepatitis B virus and emergence of resistant mutant［J］.Gastroenterology，2005，128：708.

［3］Uprichard SL，Boyd B，Althage A，et al.Clearance of hepatitis B virus from the liver of transgenic mice by short hairpin RNAs［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：773.

［4］Li GQ，Gu HX，Li D，et al.Inhibition of Hepatitis B virus cccDNA replication by siRNA［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，355：398.

［5］Li GQ，Xu WZ，Wang JX，et al.Combination of small interfering RNA and lamivudine on inhibition of human B virus replication in Hep G2.2.15 cells［J］.Word Journal of Gastroenterology，2007，16：708.

［6］Colledge D，Civitico G，Locarnini S，et al.In vitro antihepadnaviral activities of combinations of penciclovir，lamivudine，and adefovir［J］.Antimicrob Agents Chemother，2000，44：551.