鄰苯二甲酸單芐酯單克隆抗體的制備

李 樂，任洪林，李巖松，周 玉，馮曉麗，劉艷艷，唐 峰，李兆輝，王光明，盧士英，柳增善

（吉林大學 人 獸共患病研究所教育部重點實驗室 畜 牧獸醫學院，吉林 長 春130062）

鄰苯二甲酸酯類（PAEs）屬于環境激素類物質，以增塑劑、軟化劑、載體等應用在化妝品、洗滌用品、建筑材料和潤滑油中［1］。人體可通過呼吸，飲食，皮膚接觸等方式攝入PAEs，進入人體內被代謝成相應的單酯，且有毒性單酯的及生物活性超過雙酯［2］。尿液中鄰苯二甲酸單芐酯（mono－benzyl phthalate，MBzP）與精子的活力和精子的濃度有關，可影響生殖系統的相關激素的水平，對胎兒及男性生殖系統有一定的影響［3，4］。研究發現 MBzP對SD大鼠具有胚胎毒性，可引起胚胎生長緩慢，同時對胚胎有致畸作用。目前，對MBzP的檢測方法主要是反相高效液相色譜分析法（HPLC），此方法費高，時長，無法用于現場檢測。而免疫法有速度快、費用低、儀器易攜、靈敏度高和選擇性強等優點。本研究通過制備鄰苯二甲酸單芐酯的單克隆抗體為免疫學檢測奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Balb／c小鼠，雌性，8－10周齡，購于長春生物制品研究所；SP2／0－Ag14小鼠骨髓瘤細胞，為本實驗室保種傳代。

1.2 主要試劑 MBzP購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、鄰苯二胺（OPD）、HAT、HT、50%PEG1000等購自美國Sigma公司；四季清胎牛血清為長春寶泰克生物制品有限公司產品；PRMI－1640培養基購自GIBCO公司；辣根過氧化物標記羊抗鼠IgG購自中杉金橋。

1.3 主要儀器 倒置顯微鏡（Olympus）；CO2培養箱（上海力新公司）；96孔可拆卸酶標板、酶聯免疫檢測儀（NUNC公司）。

1.4 方法

1.4.1 MBzP完全抗原的制備 利用 MBzP分子中的羧基在N，N－二環己基碳二亞胺的作用下與N－羥基琥珀酰亞胺反應生成活潑酯衍生物，后者與載體蛋白的氨基反應，形成以酰胺鍵連接的偶聯物，具體制備方法參照文獻［5，6］。完全抗原用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行鑒定。

1.4.2 小鼠的免疫 MBzP－BSA與等量的弗氏完全佐劑混合乳化，皮下多點注射免疫，100μl／只，免疫三只；每隔15 d免疫一次，三免后第7 d，小鼠斷尾采血，用ELISA法檢測血清效價，具體步驟參見文獻［7］。

1.4.3 單抗的制備 血清效價達到細胞融合要求后，進行細胞融合。采用有限稀釋法將陽性雜交瘤細胞克隆化，直到克隆細胞陽性率達到100%時再進行擴大培養。采用體內誘生法制備腹水，利用辛酸－硫酸銨方法純化腹水［8］。然后對純化的腹水進行SDS－PAGE鑒定，檢測純化后腹水的抗體純度。1.4.4 單抗的亞類及親和力的鑒定 利用小鼠單抗亞類鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的亞類類型。按照試劑盒說明書操作。利用間接ELISA方法對抗體的親和力進行測定［9］。

2 結果

2.1 MBzP完全抗原的鑒定

偶聯產物因連接上小分子使其電荷數量改變，遷移速率變快，證明完全抗原制備成功。鑒定結果見圖1。

圖1 MBzP完全抗原的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結果

2.2 單抗的篩選與鑒定 小鼠第三次免疫7 d后，檢測小鼠血清效價，按P／N≥2.1為陽性，效價可達到1∶25600，符合細胞融合的要求。選擇血清效價最高的小鼠進行細胞融合。利用間接ELISA篩選出陽性雜交瘤細胞1B9，經過三次克隆后陽性率達到100%，進行擴大培養注入小鼠體內，制備腹水。利用辛酸－硫酸銨法純化腹水，純化后的腹水進行SDS－PAGE電泳，可見清晰兩條帶，一條為重鏈，另一條為輕鏈，雜帶明顯減少，得到了相對較純的單克隆抗體。結果如圖2所示。采用間接ELISA法檢測純化后的腹水，結果顯示單克隆抗體1B9的腹水效價可達1：1.28×105。經過亞類試劑盒鑒定此株單抗亞類為Ig M。抗體的親和常數為2.32×108。

圖2 腹水純化SDS－PAGE圖

3 討論

MBzP是小分子物質，屬于半抗原，只有反應原性，不具有免疫原性，不能刺激機體產生免疫應答，需要與大分子載體蛋白偶聯后才能達到免疫效果。半抗原與載體蛋白連接時，需要根據半抗原的特性選擇合適的方法，MBzP具有羧基，可以采用活潑酯法，羰二亞胺法和混合酸酐法進行偶聯。選擇偶聯方式時應考慮半抗原的溶解度、穩定性、結合鍵的位置以及適合的偶聯試劑等因素［10，11］。這三種方法都會存在一定的副反應，本實驗采用活潑酯法進行偶聯是因為活潑酯法是對碳二亞胺法的改進，可避免蛋白質分子間的交聯［12］。合成后的人工抗原經過非變性凝膠電泳證實了完全抗原的偶聯成功，可進行下一步實驗。

細胞融合是制備單克隆抗體的關鍵步驟，本實驗采用聚乙二醇法進行細胞融合。（1）PEG分子量對細胞融合的影響：PEG的分子量越大粘性越大，毒性也越大，如加入PEG時出現細胞凝聚現象可能與其分子量有一定的關系，即分子量越大出現凝聚塊也越大。融合可選用的PEG的分子量在1000－6000均能達到一定的融合效果，但不同分子量的PEG所對應的作用時間也不相同，分子量大的相對作用時間應減少。目前，大多數選用分子量1000的PEG進行細胞融合，融合率穩定且毒性相對小些。（2）PEG的作用時間對細胞融合的影響：PEG具有一定的毒性，作用時間過長會對細胞造成一定的損傷，作用時間過短會使細胞融合不充分。經試驗摸索作用時間為40－120 s內可得到較好的融合效果。（3）PEG的p H對細胞融合的影響：一般PEG的p H在6.8－7.4之間即可，但也有報道顯示在偏堿條件下，p H＝8.0時的融合效果比較好［13］。（4）溫度對PEG的融合的影響：PEG在37－40℃的條件下有助于提高融合率，可能是因為溫度對細胞膜的流動性有一定的影響，隨著溫度的升高膜的流動性及通透性都會有所加強［14］。控制好細胞融合的條件是提高細胞融合率的前提保障，在細胞融合24 h后可粗略看下細胞是否有污染，HAT是否有效的抑制了骨髓瘤細胞的生長，因為HAT存放時間過長可能導致其失效，如果發現細胞孔內細胞的數量有明顯增多的現象說明HAT失效，此時應及時補加有效的HAT，如無任何異常情況，盡量不去觀察或移動細胞。在融合的第6 d進行換液，因為此時細胞處于生長緩慢的潛伏期，比較脆弱，過早換液或經常移動不利于細胞的穩定生長。在隨后的細胞培養中也可能會出現細胞生長緩慢，逐漸皺縮，死亡的狀態，所以，在細胞的生長期應密切注意觀察細胞的狀態，如發現異常，應及時對所用試劑包括培養基的血清含量、培養基的酸堿度、雙抗的濃度及細胞培養箱中CO2的含量、溫度和水分是否充足等進行排查，及時找出原因挽救細胞［15］。

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