實時熒光PCR檢測胃癌石蠟組織中Her-2表達的研究

李明新，于忠和，范晉楠

(1.北京軍區總醫院全軍腫瘤內科診治中心，北京100700;2.山西醫科大學第二臨床醫學院，太原030001)

人表皮生長因子受體2(human epidermal growth fact or receptor 2，Her-2)是一種酪氨酸激酶受體，是表皮生長因子受體家族成員。Park等［1］研究證實Her-2是胃癌的獨立預后因素。目前檢測Her-2/neu的最常用的方法有免疫組織化學法和熒光原位雜交，這兩種方法各有優點，但也都存在很多不足，因此探尋新的檢測方法成為必然。本試驗收集免疫組織化學方法對胃癌組織Her-2情況進行檢測的病例資料，探討它們在胃癌組織中表達的相關性，并用實時熒光聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)的方法對其蠟塊組織進行Her-2檢測，希望能為胃癌組織中Her-2檢測提供新的方法和思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009～2011年北京軍區總醫院腫瘤內科、普外科、山西腫瘤醫院行免疫組織化學檢測其Her-2蛋白表達情況的71例經病理確診胃癌的組織蠟塊病理數據。所有患者術前均未行化療、放療和免疫治療，其中腺癌70例(包括乳頭狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌)，鱗癌1例。潰瘍型37例，非潰瘍型34例;患者年齡范圍30～80歲，平均年齡58.5歲;其中男55例，女16例。根據WHO分類標準，中低分化胃癌37例，高分化34例;有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移46例;漿膜浸潤31例，未浸潤漿膜40例。賁門部胃癌28例，胃竇部胃癌15例，胃體部胃癌28例。TNM分期:Ⅰ/Ⅱ期 46例，Ⅲ/Ⅳ期25例。

1.2 試劑和儀器 試劑:QIAGEN(QIAanp DAN FFPE Tissue)試劑盒、實時熒光PCR反應試劑盒購自北京雅康博生物科技有限公司。儀器:NanoDrop微量紫外分光光度計、Heraeus臺式高速離心機、生物安全柜、電熱恒溫水槽、數顯電熱培養箱、實時熒光PCR儀器(Agilent Technol-ogies Stratagene Mx3000P)等。

1.3 方法

1.3.1 收集資料 病案室查找病例，統計胃癌患者的病理數據。

1.3.2 提取DNA 自行分離石蠟包埋組織中的腫瘤組織，DNA提取按照試劑盒QIAGEN(QIAanp DAN FFPE Tissue)說明書進行。自提取的DNA樣本中，吸取1 μL樣本置于分光光度計小孔上，自動檢測樣本中DNA濃度。將提取的DNA置于－20℃冰箱保存。

1.3.3 RT-PCR反應 將提取的DNA樣本稀釋到20～50 ng/μL，按實時熒光PCR反應試劑盒說明書用8聯管進行加樣，輕彈混勻后短暫離心，放置于實時熒光PCR儀中進行擴增反應:預變性95℃，10 min，1個循環;95℃，15 s和60℃，1 min，40個循環，在退火階段進行熒光采集。

1.3.4 結果判讀 根據熒光定量PCR儀的使用說明調整基線，將閾值設定在熒光值對數圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。如果陰性對照品不呈典型的S型曲線或無Ct值，陽性對照品呈典型的S型曲線且5＜Ct值＜35，待檢DNA樣品在內參及Her-2檢測試劑檢測中呈典型的S型曲線且5＜Ct值＜35，則可繼續分析。待檢DNA樣品中Her-2基因相對基因拷貝數(X)由目的基因和參照基因的Ct值的差異計算出來。計算公式為:X=K×2－ddCt(K校正系數)，待檢樣品在內參、Her-2檢測試劑中擴增的Ct值分別記為Ct1、Ct2，陽性對照品在內參、Her-2檢測試劑中擴增的Ct值分別記為Ct3、Ct4。ddCt=(Ct2－Ct1)－(Ct4－Ct3)。當 X＞4.5時，判斷為 Her-2基因擴增陽性;當X＜2時，判斷為Her-2基因擴增陰性;當2＜X＜4.5時，判斷為不確定，可通過熒光原位雜交進行確定。

1.4 統計學方法 所有研究資料和實驗數據均采用SPSS 17.0統計軟件進行處理。結果分析進行Pearsonχ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學法 胃癌組織中Her-2的過表達率為22.5%，Her-2的過表達與胃癌的部位、有無淋巴結轉移及TNM分期有顯著的相關性(P＜0.05)，與年齡、性別、分化程度、大體分型、浸潤深度無顯著相關性(P ＞0.05)(表1)。

表1 胃癌組織中Her-2的表達與臨床特征的關系

2.2 配對設計的71例組織蠟塊Her-2表達狀態，免疫組織化學法Her-2過表達者16例(22.5%)，實時熒光PCR法Her-2過表達者14例(19.7%)，陽性一致率為76.5%(13/17)，陰性一致率為 93.1%(54/58)，總一致率為94.4%(67/71)，兩種方法的檢測結果無明顯差異(P ＞0.05)(表2)。

表2 免疫組化與實時熒光PCR兩種檢測方法的比較

3 討論

Her-2基因定位于第17號染色體的17q21，是表皮生長因子受體家族中的一個成員，編碼具有酪氨酸激酶活性的一種185×103的跨膜糖蛋白。可從多個途徑影響腫瘤細胞的生物活動，如腫瘤細胞增殖、黏附、轉移和分化等相關基因的調控。Her-2作為乳腺癌患者重要的預后指標、對化療治療反應的預測因子及曲妥珠單抗靶向治療的靶點已被醫學界所證實［2］。2009年美國臨床腫瘤學會(ASCO)會議上報道的一項多中心隨機對照的國際Ⅲ期臨床研究To-GA試驗［3］，為晚期胃癌的靶向治療掀開了新的篇章，并確定了Her-2檢查在胃癌臨床診治中的地位，Her-2對胃癌有預測價值;同時也奠定了曲妥珠單抗在胃癌治療中的地位。基于該實驗結果，赫賽汀擴大了其適應證，2010年1月，在歐洲赫賽汀用于治療Her-2陽性的晚期胃癌的申請已獲得了批準。

本研究結果顯示，胃癌組織中Her-2的過表達率為22.5%，Her-2的過表達與胃癌的部位、有無淋巴結轉移及TNM分期有顯著的相關性(r值分別為0.294、0.41、0.354，P ＜0.05)，其中賁門部過表達率最高(35.7%)，胃竇次之 (26.7%)，胃體最低(7.1%)，與 ToGA 試驗［3］結果相似:胃癌組織 Her-2陽性率中國大陸為23%，并受腫瘤部位、病理類型和標本類型等多種因素影響，胃食管連接部位癌Her-2陽性率比胃癌高，分別為33.2%和20.9%(P ＜0.01)。而楊吉利等［4］的研究也表明Her-2的過表達與腫瘤分化程度、臨床分期密切相關。郭建波［5］的研究Her-2蛋白在胃癌組織的陽性表達率為22.4%(15/67)，而在癌旁正常組織無表達，Her-2表達與患者的性別、年齡、分化程度均無相關關系(r值分別為0.118、0.020、0.088，P ＞ 0.05)，而與腫瘤的 Lauren分類、臨床分期及淋巴結轉移相關(r值分別為0.294、0.31、0.296，P ＜0.05)。

目前檢測Her-2最常用的方法是免疫組化，進一步是熒光原位雜交。免疫組織化學技術因具有簡便、廉價，是目前國內檢測HER-2狀態的主要方法。但該技術受組織固定、處理、抗體批次及觀察者主觀性等的影響，結果差異性很大，敏感性和特異性差，使Her-2檢測結果存在著一定的不確定性。熒光原位雜交法結果判讀準確，敏感性和特異性高，但實驗過程較復雜，相對耗時，費用較昂貴，失敗率偏高。本實驗同時用定量熒光PCR法對樣本進行了檢測，對兩種方法進行比較，發現陽性一致率為76.5%(13/17)，陰性一致率為 93.1%(54/58)，總一致率為94.4%(67/71)，兩種方法的檢測結果無明顯差異(χ2=0.25，P ＞ 0.05)。Barberis 等［6］在乳腺癌的研究也表明兩種方法有高度的一致性(82%)，而且在所有美國食品藥品管理局批準的檢測中PCR技術具有成本-效益優勢。Bossard等［7］在乳腺癌中的研究中兩種方法一致率為84%，PCR是檢測Her-2表達狀態的備選方法。Tse等［8］的研究中參考于免疫組織化學法，PCR的靈敏度為87.5%，特異度為100%;而參考于熒光原位雜交，PCR的靈敏度為89.5%，特異度為92%。Nistor等［9］的研究表明，PCR和熒光原位雜交的一致率為92%。同時還有很多實時PCR能對乳腺癌石蠟組織中Her-2的擴增及表達進行準確檢測的報道［10-11］。而且實時熒光PCR法1次試驗可同時檢測46個標本，能滿足大醫院臨床檢測和實驗室的需要。鑒于兩種方法的結果不完全一致可能是在實驗過程中受標本采集、處理及觀察者主觀性等的影響引起，在這些方面，定量熒光PCR顯然更具優勢。

綜上所述，實時熒光PCR具有簡便、客觀、高效、可重復性高等特點，其檢測結果與免疫組化和熒光原位雜交的結果有很高的一致性，且具有明顯的成本-效益優勢，可望成為胃癌組織中除免疫組化和熒光原位雜交外檢測Her-2表達狀態的一種備選方法。

［1］Park DI，Yun JW，Park JH，et al.HER-2/neuamplification is an independent prognostic factor in gastric cancer［J］.Dig Dis Sci，2006，51(8):1371-9.

［2］Wolff AC，Hammond ME，Schwartz JN，et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor2 testing in breast cancer［J］.Arch Pathol Lab Med，2007，131(1):18-43.

［3］Bang YJ，Van Cutsem E，Feyereislova A，et al.Trastuzumab in combination with chemotherapy versuschemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer(ToGA):a phase 3，open-label，randomisedcontrolled trial［J］.Lancet，2010，376(9742):687-97.

［4］楊吉利，王長宏，張越，等.EGFR、HER2、VEGF在胃癌組織中的表達及相關因素分析［J］.中國實驗診斷學，2011，15(2):247-250.

［5］郭建波.HER-2/neu蛋白在胃癌中的表達及意義［J］.大連醫科大學學報，2010，32(5):505-508.

［6］Barberis M，Pellegrini C，Cannone M，et al.Quantitative PCR and HER2 testing in breast cancer:a technical and cost-effectivenessanalysis［J］.Am J Clin Pathol，2008，129(4):563-70.

［7］Bossard C，Bieche I，Le Doussal V，et al.Real-time RT-PCR:a complementary method to detect HER-2 status in breast carcinoma［J］.Anticancer Res，2005，25(6C):4679-83.

［8］Tse C，Brault D，Gligorov J，et al.Evaluation of the quantitative analytical methods real-time PCR for HER-2 gene quantification and ELISA of serum HER-2 protein and comparison with fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry for determining HER-2 status inbreast cancer patients［J］.Clin Chem，2005，51(7):1093-101.

［9］Nistor A，Watson PH，Pettigrew N，et al.Real-time PCR complements immunohistochemistry in the determination of HER-2/neu status in breast cancer［J］.BMC Clin Pathol，2006，6:2-9.

［10］Chariyalertsak S，Purisa W，Vinyuvat S.Her-2/neu amplification determined by real-time quantitative PCR and its association with clinical outcome of breast cancer in Thailand［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2011，12(7):1703-6.

［11］Page K，Hava N，Ward B，et al.Detection of HER2 amplification in circulating free DNA in patients with breast cancer［J］.Br J Cancer，2011，104(8):1342-8.