肺癌患者血漿及外周血單個核細胞Lunx m RNA檢測的臨床意義

趙文杰， 周洪興， 王蘇建， 吳建康， 王家平， 張 平

(南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院檢驗科，江蘇常州 213003)

肺癌患者血漿及外周血單個核細胞Lunx m RNA檢測的臨床意義

趙文杰， 周洪興， 王蘇建， 吳建康， 王家平， 張 平

(南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院檢驗科，江蘇常州 213003)

目的 檢測肺癌患者血漿及外周血單個核細胞肺特異性X基因(Lunx)mRNA，探討兩者對肺癌輔助診斷的臨床意義。方法 采用熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測肺癌患者、肺良性疾病患者、肺外腫瘤患者及健康人血漿及外周血單個核細胞Lunx mRNA。結果 肺癌組患者血漿Lunx mRNA陽性率顯著高于肺良性疾病組(χ2=113．10，P ＜0．01)、肺外腫瘤組(χ2=125．34，P ＜0．01)和健康組(χ2=100．33，P ＜0．01);Ⅲ ～ Ⅳ期肺癌患者血漿Lunx mRNA陽性率高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者(χ2=7．07，P＜0．05)。肺癌組患者外周血單個核細胞Lunx mRNA陽性率顯著高于肺良性疾病組(χ2=32．79，P ＜0．01)、肺外腫瘤組(χ2=44．44，P ＜0．01)和健康組(χ2=44．44，P＜0．01);Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者外周血單個核細胞Lunx mRNA陽性率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者(χ2=24．52，P＜0．01)。血漿Lunx mRNA檢測對肺癌輔助診斷的敏感性高于單個核細胞檢測的敏感性(χ2=36．46，P＜0．01)，血漿檢測的陰性預測值高于外周血單個核細胞檢測的陰性預測值(χ2=16．37，P＜0．01)。結論 血漿與外周血單個核細胞Lunx mRNA檢測均可用于肺癌的輔助診斷，前者敏感性較后者高。

肺特異性X基因;循環RNA;循環腫瘤細胞;聚合酶鏈反應;肺癌

肺癌是呼吸道常見惡性腫瘤，由于肺癌早期癥狀不明顯，一旦確診大部分已屬中晚期，早期診斷、早期治療是提高肺癌患者生存率的關鍵［1］。在常規健康體檢中，與肺癌相關檢查一般僅有胸部X光片及一些比較成熟的腫瘤標志物，如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、細胞角蛋白片段CYFRA-211、神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)等。早期肺癌腫塊較小且由于存在體位等因素的影響，X線檢查常無法顯現腫塊［2］。而上述腫瘤標志物敏感性有限且對于肺癌均不特異。尋找一種取材較易且有較高敏感性與特異性的肺癌標志物用于輔助診斷具有十分重要的意義。

有研究表明在腫瘤組織生長過程中既有腫瘤細胞亦有游離核酸進入外周血［3-5］，因此檢測血漿及外周血單個核細胞中肺癌特異基因的表達將是一種對肺癌進行輔助診斷的新思路。肺特異性X基因(lung-specific X，Lunx)是 Iwao 等［6］采用mRNA差異顯示技術篩選克隆的一個人類肺組織特異性基因，在肺以外其他腫瘤組織中不表達或表達極少［7］。檢測肺癌患者血漿及外周血單個核細胞中Lunx mRNA對肺癌可能有重要的輔助診斷價值。

材料和方法

一、研究對象

選取2008年12月至2011年1月來常州市第二人民醫院呼吸科就診，并被確診為原發性肺癌的患者108例，男65例，女43例，年齡31～87歲，平均63．1歲。所有患者住院期間均經病理切片檢查并依據國際抗癌聯盟(UICC)所提出的TNM分期標準(2009版)將患者分為Ⅰ～Ⅳ期。其中Ⅰ期19例(包括 T1N0M07例、T2aN0M012例)，Ⅱ期40例(包括 T1N1M06例、T2bN0M011例、T2aN1M013例、T2bN1M010例)，Ⅲ ～Ⅳ期49例(包括 T2N2M04例、T3N1M014例、T3N2M012例、T4N2M011例、T3N3M05例、T2N2M1a2例、T3N3M1a1例)。另選取同期來院治療的其他肺部疾病患者86例作為良性疾病組，包括大葉性肺炎33例、痰結核菌培養陽性的肺結核患者12例、慢性支氣管炎41例，年齡21～89歲，平均59．4歲。選取肺以外其他惡性腫瘤患者100例作為特異性對照組，該組患者均為原發性，包括肝癌20例、胃癌30例、食管癌20例、結腸癌30例，年齡32～83歲，平均66．2歲。選取來常州市第二人民醫院體檢，血常規、肝腎功能、胸部X光片均正常者88名作為健康對照組，年齡41～68歲，平均年齡57．8歲。

二、試劑

全血細胞RNA提取試劑盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit)、血漿RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)、去 RNA酶 DNA消化酶(RNase-Free DNase Set)購自凱杰生物技術(上海)有限公司;TaKaRa PrimeScript逆轉錄(RT)-聚合酶鏈反應(PCR)定量試劑盒、pMD18-T克隆試劑盒、質粒提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit)購自上海皓嘉科技發展有限公司;PCR引物及TaqMan探針由上海生工生物工程有限公司合成，序列為跨外顯子設計，見表1。

表1 Lunx與β-actin的定量PCR擴增引物及探針序列

三、RNA提取與逆轉錄

所有患者在未接受正規治療前均空腹采集靜脈血2．0 mL，健康對照組在前來體檢時采集靜脈血2．0 mL，所有血標本均乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，2 h內2 800×g離心15 min，吸取上層血漿800μL，按照血漿RNA提取試劑盒說明書提取血漿總RNA。剩余全血按全血細胞RNA說明書提取全血單個核細胞總RNA。提取的RNA按說明進行DNA酶消化，去除殘存的DNA。隨即按RTPCR試劑盒中逆轉錄部分的操作說明將RNA逆轉錄成cDNA。反應總體系為20μL，包括4μL 5 ×PrimeScript Buffer、4 μL Random 6 mers、1 μL oligo dT Primer、1 μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ、5μL純化的RNA及5μLRNase Free雙蒸水。于37℃ 反應15 min，然后于85℃滅活5 s，短暫離心后置－20℃ 保存。

四、熒光定量PCR

用試劑盒中定量PCR部分進行熒光定量PCR擴增。擴增儀為ABI 7000 PRISM熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)。反應體系為50 μL，包括25 μL Premix Ex TaqTM溶液，正向與反向引物各1μL(終濃度為0．2μmol/L)，熒光探針溶液2 μL(終濃度為0．2 μmol/L)，ROX Reference Dye 1μL，cDNA模板5μL及滅菌蒸餾水15μL。按如下程序進行擴增:95℃ 30 s預變性，95℃ 5 s，60℃ 31 s，擴增45循環。為了消除RNA提取、逆轉錄等標本制備步驟各標本間的效率差異，用雙標準曲線法對血漿及外周血單個核細胞Lunx mRNA進行相對定量。按照試劑盒說明書將擴增后的產物T-A克隆至pMD-18載體質粒中，經轉化、篩選等步驟后提取質粒DNA。將標準質粒按10∶1的比例依次梯度稀釋至1×108～1×102拷貝/mL，與標本同步進行 PCR擴增。分別對各標本Lunx及內參基因β-actin定量，以 Lunx與 β-actin 的定量比值“Lunx/β-actin”進行數據分析。

五、統計學方法

運用SPSS 13．0軟件，以健康組為研究對象，分別確定本實驗室血漿與外周血單個核細胞Lunx/β-actin的分布范圍，設分布范圍的上限為cut-off值，高于此值為陽性，不高于此值為陰性。陽性率的比較采用χ2檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

一、4組人群血漿Lunx/β-actin分布

本研究所采用的熒光定量PCR方法擴增Lunx與β-actin基因最低檢測限為103拷貝/mL。健康人血漿Lunx/β-actin分布范圍為0～0．26，取單側95%區間確定本實驗室血漿Lunx/β-actin分布范圍為0～0．22，以其上限0．22為 cut-off值，肺癌組、肺良性疾病組、肺外腫瘤組、健康組陽性率分別為 75．93%、0．00%、0．00%、4．55%。肺癌組患者陽性率顯著高于肺良性疾病組(χ2=113．10，P ＜0．01)、肺外腫瘤組(χ2=125．34，P ＜0．01)和健康組(χ2=100．33，P ＜0．01)，后 3 組間差異無統計學意義(P均＞0．05)。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者血漿Lunx/β-actin陽性率分別為57．89%、67．50%、89．80%，Ⅲ ～ Ⅳ期肺癌患者陽性率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者(χ2=7．07，P ＜0．05)。見圖1。

圖1 4組人群血漿Lunx/β-actin分布

二、外周血中單個核細胞Lunx陽性率

肺癌組、肺良性疾病組、肺外腫瘤組及健康組外周血單個核細胞Lunx檢測陽性率分別為36．11%、2．33%、0．00%、0．00%。肺癌組患者外周血單個核細胞Lunx陽性率高于肺良性疾病組(χ2=32．79，P ＜0．01)、肺外腫瘤組(χ2=44．44，P ＜0．01)和健康組(χ2=44．44，P ＜ 0．01)。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ ～Ⅳ期肺癌患者陽性率分別為10．53%、17．50%和 61．22%，Ⅲ ～ Ⅳ期肺癌患者外周血單個核細胞Lunx mRNA陽性率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者(χ2=24．52，P ＜0．01)。

三、血漿及外周血單個核細胞中Lunx mRNA檢測對肺癌輔助診斷的價值

血漿中Lunx mRNA的表達對肺癌輔助診斷的敏感性高于外周血單個核細胞的敏感性(χ2=36．46，P ＜0．01)，陰性預測值高于外周血單個核細胞檢測的陰性預測值(χ2=16．37，P ＜0．01)。見表2。

表2 血漿及外周血單個核細胞Lunx mRNA檢測對肺癌輔助診斷的價值 (%)

討 論

Lunx基因定位于 20p11．1-q12，cDNA 全長1 015 bp，包含一個開放的讀碼框，編碼含257個氨基酸，蛋白質的相對分子質量為 26．7×103［8-9］，是近年來發現的肺組織高度特異的基因。本研究采用熒光定量PCR檢測肺癌患者血漿及外周血單個核細胞中Lunx的表達，研究顯示肺癌組患者血漿及外周血單個核細胞中Lunx表達的陽性率均高于肺良性疾病組、肺外腫瘤組及健康對照組，提示兩者對肺癌均有一定的輔助診斷價值，并且血漿Lunx檢測對肺癌輔助診斷的敏感性顯著高于外周血單個核細胞檢測的敏感性。以往的研究顯示臨床普遍采用的肺癌相關標志物如CEA、CYFRA-211、NSE等雖然敏感性與本研究檢測血漿Lunx的敏感性相當，但特異性卻低于本研究檢測的 Lunx mRNA［10-11］。

本研究顯示4組人群血漿中僅有一小部分PCR未擴增出Lunx mRNA，包括健康人在內的其他大部分人血漿中均有一定量的Lunx mRNA存在?？赡芤驗長unx基因在正常肺組織中亦有少量表達，循環RNA的2個主要來源為凋亡和主動分泌，在正常組織細胞中也同樣存在［4］，因此大部分人血漿中均有少量循環Lunx mRNA存在。本研究顯示多數健康人及非肺癌患者外周血單個核細胞中Lunx mRNA陽性率為0．00%，而肺癌患者由于腫瘤組織增生，腫瘤細胞可能會脫落進入外周血［3］，因此肺癌患者外周血單個核細胞Lunx有一定的陽性率。血漿中的陽性率較高可能是因為游離RNA比單個細胞更易透過毛細血管壁進入外周血［12］。晚期肺癌患者由于癌組織增大并向周圍浸潤，將會有更多的循環Lunx mRNA分子或肺癌細胞進入外周血［13-14］，研究結果也證實Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者血漿及外周血單個核細胞Lunx mRNA陽性率高于早期患者，兩者對肺癌的進展性均有判斷價值。

腫瘤標志物檢測是輔助診斷惡性腫瘤的重要組成部分。用于常規篩查的理想標志物除需取材容易、檢測方便外，還應有一定的敏感性與特異性。RT-PCR檢測肺癌患者血漿Lunx mRNA，取材簡單，其敏感性和特異性好，能符合常規篩查的條件，可使肺癌的篩查效率有所提高。而對于外周血單個核細胞檢測Lunx，雖然其對肺癌輔助診斷的敏感性沒有血漿高，但研究顯示是反映肺癌細胞血行微轉移的良好標志物［6-7］。用患者外周血作為檢查材料，無論是血漿或是單個核細胞對肺癌的輔助診斷都有重要的意義。

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The clinical significance of Lunx m RNA detection in p lasma and peripheralmononuclear cells in patients w ith lung cancer

ZHAO Wenjie，ZHOU Hongxing，WANG Sujian，WU Jiankang，WANG Jiaping，ZHANG Ping．

(Department of Clinical Laboratory，Changzhou Second People's Hospital，Nanjing Medical University， Jiangsu Changzhou 213003，China)

Objective To investigate the clinical auxiliary diagnosis significance of lung-specific X gene(Lunx)mRNA detection in plasma and peripheralmononuclear cells in patients with lung cancer．M ethods Lunx mRNA in plasma and peripheralmononuclear cells was detected by fluorescence quantitation polymerase chain reaction(PCR)in patients with lung cancer，benign lung disease，extrapulmonary tumor and healthy subjects．Resu lts The positive rate of Lunx mRNA from plasma in lung cancer group was significantly higher than those in benign lung disease group(χ2=113．10，P ＜ 0．01)，extrapulmonary tumor group(χ2=125．34，P ＜ 0．01)and healthy subjects(χ2=100．33，P ＜0．01)．The positive rate of Lunx mRNA in plasma in patients with Ⅲ-Ⅳ stages of lung cancer was significantly higher than that in patients with Ⅰ-Ⅱ stages of lung cancer(χ2=7．07，P ＜ 0．05)．The positive rate of Lunx mRNA in peripheralmononuclear cells in lung cancer group was significantly higher than those in benign lung disease group(χ2=32．79，P ＜0．01)，extrapulmonary tumor group(χ2=44．44，P ＜0．01)and healthy subjects(χ2=44．44，P ＜0．01)．The positive rate of Lunx mRNA in peripheral mononuclear cells in patients withⅢ-Ⅳ stages of lung cancer was significantly higher than that in patients with Ⅰ-Ⅱ stages of lung cancer(χ2=24．52，P ＜ 0．01)．For the auxiliary diagnosis of lung cancer，the sensitivity of Lunx mRNA detection in plasma was higher than that in mononuclear cells(χ2=36．46，P ＜0．01)．The negative predictive value of the Lunx mRNA detection in plasma was higher than that in mononuclear cells(χ2=16．37，P ＜ 0．01)．Conclusions The detection of Lunx mRNA in plasma and peripheral mononuclear cells can be used for the auxiliary diagnosis of lung cancer．The sensitivity in plasma is higher than that in mononuclear cells．

Lung-specific X gene;Circulating RNA;Circulating tumor cell;Polymerase chain reaction;Lung cancer

2011-11-25)

(本文編輯:范基農)

1673-8640(2012)08-0631-04

Q503

A

趙文杰，男，1971年生，主管技師，主要從事血液學檢驗工作。

周洪興，聯系電話:0519-81087713。