多指標優選清肝消痤顆粒水提工藝研究

戴 薇

（江蘇省中西醫結合醫院，江蘇 南京 210028）

清肝消痤顆粒［1，2］系江蘇省中西醫結合醫院臨床經驗方，由梔子、丹參、甘草等藥味組成，具有清肝利濕，化痰散結的功效。該方療效確切，為了更好地控制產品質量，本實驗以方中的梔子苷、丹參素、甘草酸銨的含量為指標，采用多指標評分法優選清肝消痤顆粒的水提工藝，為制定該該制劑的合理提取工藝提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（Alliance 2695四元泵及自動進樣系統，996二極管陣列檢測，Empower色譜工作站）；Millipore Milli-Q純水器；METTLER萬分之一及十萬分之一電子天平（瑞士）。

1.2 試藥

梔子、丹參等藥材均購自南京藥業股份有限公司中藥飲片廠，經南京中醫藥大學鑒定教研室鑒定均為2010年中國藥典一部收載品種。梔子苷、丹參素、甘草酸銨對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號依次為：0749-200007、110855-200203、10731-200205），供含量測定用；重蒸水；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 水提工藝正交［3］試驗優選

2.1.1 浸泡條件優選

按處方比例，稱取2副藥材，加10倍量水浸泡，每隔30min觀察一次，結果2h后所有藥材基本浸透，吸水量約2倍。因此藥材在煎煮之前先浸泡2h。

2.1.2 正交試驗設計

根據預試驗，對影響水提取工藝的主要因素：加水量、提取時間、提取次數按四因素三水平進行L9（34）正交試驗。各因素水平見表1。

表1 水提因素水平

2.1.3 正交試驗樣品制備

按處方比例稱取梔子、丹參、甘草等藥材適量，分別按正交試驗表設計安排進行試驗，合并煎煮液，濾過，濾液濃縮定容至500mL。

2.1.4 含量測定

選擇2017年10月至2018年6月在南京醫科大學附屬無錫第二醫院眼科檢查確診的NAION患者18例（18眼）作為NAION組。其中男8例，女10例。年齡38～78（60.5±10.6）歲，病程3.5～8.0（4.8±1.8）個月。

梔子苷［4-5］的含量測定如下所示：

（1）色譜條件：色譜柱：Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）；流動相：乙腈-水（12：88）；流速：1.0mL／min；檢測波長：240nm；柱溫：30℃。

（2）對照品溶液的制備：精密稱取梔子苷適量，加甲醇溶解制成每1mL含369.0μg的梔子苷對照品溶液。

（3）線性范圍考察：精密吸取梔子苷對照品溶液0.5、1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積。以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，求得其回歸方程為：Y＝1958169X-168000，r＝0.9999。以上結果表明，在0.185～7.380μg／mL范圍內，梔子苷峰面積積分值與進樣量有良好的線性關系。

（4）精密度試驗：精密吸取對照品溶液（55.35μg·mL-1），連續進樣5次，每次20μL，峰面積的RSD 0.1%（n＝5）。

（5）供試品的制備：精密吸取樣品液1mL置25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，即得供試品液，注入高效液相色譜儀，見圖1，由峰面積計算含量，測定結果見表2。

圖1 樣品中的梔子苷色譜

丹參素的含量測定如下［6，7］：

（1）色譜條件：色譜柱：Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）；流動相：乙腈-0.5%乙酸（3：97）；流速：1.0mL／min；檢測波長：279nm；柱溫：35℃。

（2）對照品溶液的制備：精密稱取丹參素適量，加甲醇溶解制成每1mL含0.796mg的丹參素對照品溶液。

（3）線性范圍考察：精密吸取丹參素對照品溶液1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積。以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，求得其回歸方程為：Y＝4.75×105X-7.84×104，r＝0.9999。以上結果表明，在0.796～15.920μg／mL范圍內，丹參素峰面積積分值與進樣量有良好的線性關系。

（4）精密度試驗：精密吸取對照品溶液（0.0998 mg·mL-1），連續進樣5次，每次20μL，峰面積的 RSD 0.6%（n＝5）。

（5）供試品的制備：精密吸取樣品液2mL置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，即得供試品液，注入高效液相色譜儀，見圖1，由峰面積計算含量。測定結果見表2。

甘草酸銨［8，9］的含量測定：

（1）色譜條件：色譜柱：Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）；流動相：乙腈-0.5%乙酸（37：63）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：250nm；柱溫：35℃。供試品的高效液相色譜圖見圖1。

（2）對照品溶液的制備：精密稱取甘草酸銨適量，加甲醇溶解制成每1mL含0.542mg的甘草酸銨對照品溶液。

（3）線性范圍考察：精密吸取甘草酸銨對照品溶液1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積。以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，求得其回歸方程為：Y＝6.72×105X-2.52×104，r＝0.9999。以上結果表明，在0.542～10.84μg／mL范圍內，甘草酸銨峰面積積分值與進樣量有良好的線性關系。

（4）精密度試驗：精密吸取對照品溶液（84.5 μg·mL-1），連續進樣5次，每次20μL，峰面積的RSD 1.0%（n＝5）。

（5）供試品的制備：精密吸取樣品液2mL置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，即得供試品液，注入高效液相色譜儀，見圖1，由峰面積計算含量。測定結果見表2。

2.2 結果

2.2.1 測定結果

將1～9號實驗綜合評分進行極差分析，結果見表2。

表2 水提正交試驗及結果

2.2.2 方差分析結果

將1～9號實驗綜合評分進行方差分析，結果見表3。

表3 方差分析結果

2.2.3 正交優選結果

由表2可見，影響水煎煮效果的主要因素中，提取次數（C）對指標成分的影響最大，加水量（A）次之，提取時間（B）影響最小。最優水平組合為A3B3C3，即12倍量水煎煮3次，每次90min。由表3可見，提取次數（C）對指標成分的提取有顯著影響，而加水量（A）、提取時間（B）無顯著影響。綜合表2、表3分析結果，本著節能增效的原則，確定煎煮工藝為：A2B2C3，即加10倍量水煎煮3次，每次60min。

2.3 驗證試驗

按處方比例稱取梔子、丹參等藥材，分別按A3B3C3和A2B2C3優選工藝條件進行試驗，合并煎煮液，濾過，濾液濃縮定容至500mL。分別對指標成分進行含量測定，結果如表4。

表4 驗證試驗結果

由表4可見，我們確定的提取工藝A2B2C3與正交試驗最優工藝A3B3C3對指標成分的提取比較接近，而比正交試驗中含量最高的一組試驗略高，說明確定的工藝合理。

3 討論

處方中梔子苷、丹參素和甘草酸銨的水溶性較好，故考慮用水提法對藥材進行提取，考察了加水量、煎煮時間和提取次數提取率的影響，其中提取次數的影響較為顯著，結合實際生產中節約成本和時間的原則，選擇10倍量水煎煮3次，每次60min的提取工藝。

本實驗采用HPLC對方中梔子苷、丹參素、甘草酸銨含量進行測定，運用多指標綜合評分法對清肝消痤顆粒的水提方法進行優選，方中梔子為君藥，丹參和甘草為臣藥，根據三藥的主要成分在處方中的藥理作用確定其權重系數更有科學性和合理性，對工業生產可以起到積極的指導作用。

［1］鞠建明，錢大瑋，朱玲英，等.清肝消痤顆粒定性定量方法研究［J］.中國新藥雜志，2006，15（1）：44-46.

［2］鞠建明，錢大瑋，朱玲英，等.清肝消痤顆粒的精制工藝研究［J］.中成藥，2006，28（6）：899-901.

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［5］陳偉康，方建和，丁銀平.RP-HPLC法測定清肝利膽膠囊中梔子苷［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（7）：71-73.

［6］楊瑞芬，李素娟，樊文娟，等.RP-HPLC法測定丹參緩釋片中丹參素含量［J］.湖北中醫學院學報，2008，10（1）：34-36.

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