HPLC法測定鹽酸莫西沙星含量及其有關物質

馬好

莫西沙星(moxifloxacin)是德國的拜耳公司研發出來的第四代的氟喹諾酮類超廣譜抗生素，第三代的抗革蘭陰性菌的活性被它保留了下來，它的8-甲氧基部分使抗革蘭陽性菌的活性得到了顯著提高，尤其是使對厭氧菌的抗菌活性得到了改善［1］。在1999年的時候德國首次上市，在2002年的時候在我國得以上市，拜復樂是其商品名［2］。因為其能快速吸收，且在體內的分布非常的廣，較之于β-內酰胺類抗生素，在臨床上治療相當一部分的致病菌時莫西沙星的的療效要更好一些［3］。2009年被英國藥典收載的關于莫西沙星的質量標準里需要逐一的控制多個相關物質，結構圖詳見下圖1，一般使用的是HPLC的分析方法，然而根據其標準借助于苯基硅烷鍵合硅膠柱來測定，在對峰定位對照品里的五個雜質進行分離時，分離度并不理想，所以筆者構建了通過常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠作填充劑的HPLC的分析方法，該方法有較好的專屬性，極易操作，能夠在測定鹽酸莫西沙星的含量和相關物質含量時使用［4］。

圖1 莫西沙星結構

1 材料

1.1 試劑和藥品 鹽酸莫西沙星對照品(純度高達99.9%，批號是 MX-124-4)，鹽酸莫西沙星(批號是 20100603，20100601，20100602)，它的螯合物，環合酯，(RS，SR)并不是對映異構體(批號是MX-100506-2)(制造商為江蘇的永達藥業有限公司);莫西沙星峰定位的對照品(制造商是深圳倍素特科技有限公司，批號是Y0000717，包括5～9種雜志)，甲醇(色譜純，制造商是美國的Tedia有限公司)，剩下的別的試劑都是市售分析純，所用的水是純凈水。

1.2 儀器 本次研究中使用的儀器主要有:德國賽多利斯公司生產的PB-20 pH計與BP190S天平;日本島津公司生產的UV-2041紫外分光光度計及柱溫箱;浙江大學的智能信息工程研究所生產的N2000色譜工作站;SPD-10Avp型紫外檢測器與LC-10ATvp型高效液相色譜儀等等。

2 方法

2.1 色譜條件與系統的適應性 色譜柱是Sepax BR-C18(尺寸為250毫米×4.6毫米，5 μm);流動相是甲醇-緩沖液(是將0.5 g的四丁基硫酸氫銨、1 g的磷酸二氫鉀及3.4 g的磷酸放入1升的水里溶解而成的)(28∶72)，檢測流速是每分鐘 1.3 ml，波長是 293 nm;柱溫是 45℃;進樣量:20 μl。

稀釋液:在500 ml的水里放入0.5 g的四丁基硫酸氫銨與1 g的磷酸二氫鉀并進行溶解，加入2 ml的磷酸，0.05 g的無水亞硫酸鈉，在它們完全的溶解之后，加入1升的水進行稀釋。

2.2 方法專屬性

2.2.1 分離鹽酸莫西沙星和相關的物質的效能 在生產過程中，進行鹽酸莫西沙星的合成時或許會有相關物質的引進，所以需要進行分離。精密的稱定5 mg的莫西沙星峰定位對照品，放在10 ml量瓶里，放入稀釋液溶解且稀釋至刻度，搖晃均勻，取出20 μl向液相色譜儀中注入，將色譜圖(圖2-A)記錄下來，實驗表明，莫西沙星能很好的和各種雜質分離開來，每一種雜質之間的分離度都超過了1.5，拖尾因子都低于2.0。結果詳見圖2(B～D)。

圖2 色譜圖

2.2.2 降解產物的檢出和確定 在50 ml的量瓶里放入25 mg的本品，將3%雙氧水5 ml，6 mol/L鹽酸2 ml及1 mol/L氫氧化鈉2 ml分別的加入進去，加熱2 h后，并冷卻至室溫，將pH調節至中性，用稀釋液稀釋到刻度，搖晃均勻，將20 μL的續濾液取出并做檢測。再取適量的本品，在130℃的烘箱里進行八小時的放置，在4 500 lx的光照條件中存放十天，取25 mg的光照與高溫放樣樣品，放在50 ml的量瓶里，取20μL的續濾液20進樣，將色譜圖記錄下來。結果發現，本色譜條件可以檢測出鹽酸莫西沙星的相關物質，對本品質量能進行有效的控制。

2.3 定量限和檢測限 取適量的鹽酸莫西沙星，借助于稀釋液進行溶解同時進行逐級的稀釋，在測定時取20 μL，用信噪比(S/N)3及10分布的來明確鹽酸莫西沙星的定量限與檢測限，經研究發現，6.25×10-3μg/ml是鹽酸莫西沙星的檢測限，0.025μg/ml則是其定量限。

2.4 耐用性試驗 主要使用的是柱溫(±5℃)、測波長(±5 nm)、不同色譜柱及調節流動相比例(±5%)，對主峰與相鄰的雜質峰之間的分離度進行測量并觀察主峰的純度與拖尾因子，得出，在柱溫各異的情況下鹽酸莫西沙星的耐用性不好，但其余的色譜情況里的色譜行為都可以滿足系統在適用性方面的要求，有理想的耐用性。

2.5 含量測定方法學

2.5.1 線性范圍 經研究發現，鹽酸莫西沙星在38.55～57.82 μg/ml的濃度范圍里時能夠和峰面積保持一個理想的線性關系。

2.5.2 進樣精密度和重復性 經研究，發現該測定辦法有較好的重復性與進樣精密度。

2.5.3 穩定性 通過實驗發現，在室溫情況下，放置樣品溶液8各小時后，溶液可以繼續保持穩定。

3 討論

3.1 檢測波長的確定 取適量的本品原料，借助于稀釋液稀釋成10 μg/ml的溶液，在200～400 nm的波長范圍里掃描，發現它的紫外的吸收波長的最大值是293.6 nm，因此，我們將293 nm視為檢測波長。

3.2 選擇色譜柱 在使用苯基柱對峰定位雜質對照品進行測定時，發現有五個雜質峰的分離度不理想，能分離出來的只有三個峰，對流動相比例是甲醇-緩沖液(23∶77)進行調節，依然無法全部檢出五個峰全部檢出(圖略)。所以筆者構建了通過常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠作填充劑的HPLC的分析方法，該方法有較好的專屬性，極易操作，能夠在測定鹽酸莫西沙星的含量和相關物質含量時使用。

3.3 控制柱溫 通過耐用性的實驗，我們發現在柱溫40℃的情況下拖尾因子是0.77，而拖尾因子在柱溫為50℃時是1.74，較低的柱溫會造成色譜峰前沿長，但柱溫高的情況下會導致色譜峰拖尾，所以我們在進行實驗時應嚴格的控制柱溫，切忌過高，避免造成拖尾。

［1］ 張亞坤，張志清，楊濤，等.鹽酸莫西沙星氯化鈉注射液在Beagle犬體內的藥物動力學.中國醫藥工業雜志，2010，4(1):3-5.

［2］ 尹華，吳建敏，俞如英，等.HPLC法測定沙納唑的含量及其有關物質.藥物分析雜志，2003，2(4):31-32.

［3］ 王銀蘭，李曉玲，楊潔.反相高效液相色譜法分析注射用鹽酸洛美沙星.寧夏醫科大學學報，2008，30(2):251-253.

［4］ 黃玫.反相高效液相色譜法測定鹽酸莫西沙星氯化鈉注射液的含量.現代醫藥衛生，2011，1(1):29-30.