小鵝瘟研究進(jìn)展

甘軍紀(jì) 魏平華（ 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇揚(yáng)州 5009 廣州格雷特生物科技有限公司 廣州 50730）

小鵝瘟 (Gosling plague,GP)是由鵝細(xì)小病毒(Goose Parvovirus,GPV)引起雛鵝和雛番鴨的一種高度接觸性和致死性疾病,是目前危害水禽業(yè)健康發(fā)展的最嚴(yán)重的傳染病之一，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。小鵝瘟由方定一教授于1956年在揚(yáng)州市首先發(fā)現(xiàn)，1961年從病死雛鵝體中分離到病毒,并對病毒的各種特性及特異性防治制劑進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究[1-4]。1966年匈牙利學(xué)者德金氏(Derzsy′s)用鵝胚首次分離到病毒，1974年，世界家禽協(xié)會將該病定名為Derzsy′s 病[4-5]。

1 病原

小鵝瘟病毒屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬成員，病毒顆粒直徑20～22nm（圖1）[6]，不能凝集禽類、哺乳動物和人類的紅細(xì)胞[4,7]。病毒對外界因素的抵抗力很強(qiáng),能抵抗乙醚、氯仿、胰酶、pH 3和56℃3h作用處理。抗原分析表明，國內(nèi)外所有GPV分離株屬于同一個(gè)血清型[4,5,8]。GPV可在鵝胚、鴨胚及其細(xì)胞上適應(yīng)和培養(yǎng)。

圖1 GPV電子顯微鏡照片（標(biāo)尺:100 n m）[6]

GPV實(shí)驗(yàn)室感染雛鵝或雛番鴨后，病毒在體內(nèi)呈廣泛分布，尤其在肝、脾、哈德斯腺、胸腺和法氏囊中病毒含量較高[9,10]。因此，病鵝的心血、肝臟、脾臟、腦及腸管和腸內(nèi)容物均可用于病毒分離。病料用生理鹽水或 PBS 研磨制成 1∶5～1∶10 懸液，3000r/min離心10min，每1mL上清加入青霉素、鏈霉素各1000IU，37℃孵育30min，接種12～14日齡鵝胚絨毛尿囊膜（CAM）或尿囊腔，接種后3～7天，鵝胚死亡。死亡鵝胚病變表現(xiàn)為:CAM增厚并有灰白色壞死點(diǎn)，鵝胚全身充血，翅尖、趾、頸部和喙旁有嚴(yán)重的出血點(diǎn)。肝臟充血及邊緣出血，心肌、后腦出血，頭部、頸部及兩肋皮下均有水腫[4,11]。

2 流行病學(xué)

小鵝瘟主要發(fā)生于3～30日齡雛鵝。雛鵝通常3～5日齡發(fā)病，2～3天迅速蔓延至全群，在7～10日齡發(fā)病率和死亡率達(dá)到高峰，死亡率50%以上，以后逐漸下降。年齡越小，死亡率越高，可達(dá)100%。年齡大的病鵝，其癥狀較輕，病程較長[4,12]。20世紀(jì)80年代后，45～55日齡的鵝有發(fā)生典型的小鵝瘟而大量死亡的病例[8]。90年代發(fā)現(xiàn)雛番鴨感染GPV病例,發(fā)病率50%～70%，病死率達(dá)40%～65%[11]。病雛鵝和帶毒成年鵝是本病的傳染源，在自然情況下主要通過消化道感染。健康雛鵝通過與病鵝、帶毒鵝的直接接觸或采食被病鵝、帶毒鵝排泄物污染的飼料、飲水及接觸被污染的用具和環(huán)境（如鵝舍、炕坊等）都可以引起本病的傳播[4]。

3 臨床癥狀

本病的潛伏期為3～5天。3～5日齡病鵝，通常表現(xiàn)最急性的敗血癥狀，病程只有1天左右,病鵝表現(xiàn)精神委頓、絕食等癥狀后即告死亡,死亡率可達(dá)100%。6～15日齡發(fā)病鵝，通常表現(xiàn)為急性型，表現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)，或伏地不肯起立；呼吸困難，鼻孔流漿液性分泌物；腹瀉，泄出物呈灰白色或淡黃綠色米泔水狀并混有氣泡，肛門突出，被毛潮濕并沾有污物；1～2天死亡，瀕死前頭頸伏地、兩肢麻痹，或?yàn)l死前扭頸抽搐，或是出現(xiàn)勾頭、仰頭、角弓反張等神經(jīng)癥狀。15日齡以上發(fā)病鵝，通常表現(xiàn)為亞急性型，以精神委頓、縮頭垂翅、消瘦和拉稀為主，病程為3～7天或更長，少數(shù)幸存者能自行康復(fù)，但在一段時(shí)期內(nèi)生長不良[2,4]。

4 病理變化

本病的特征性病變是小腸（空腸、回腸）發(fā)生急性卡他性-纖維素性壞死性腸炎。腸管外觀極度膨大，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，長約2～15cm，狀如香腸[4]。剖開后可見灰色或淡黃色的栓子將腸管全部塞滿。切開栓子，中心為深褐色干燥的腸內(nèi)容物，外面包有纖維素性滲出物和壞死物凝固形成的外衣（圖2）。有些病例在小腸內(nèi)形成帶狀，似絳蟲樣纖維素性凝固物。小腸黏膜與假膜脫落后，仍保持其光滑的表面，無潰瘍，腸壁菲薄，結(jié)構(gòu)完全破壞。腸壁平滑肌纖維發(fā)生實(shí)質(zhì)變性和空泡變性以致蠟樣壞死。直腸黏膜腫脹充血，有明顯的出血點(diǎn)或出血斑。心肌蒼白，心包積液；肝腫脹呈黃色，膽囊腫脹，充滿稀黃膽液[4,12-13]。

圖2 小腸內(nèi)形成的栓子將腸管塞滿

5 診斷

根據(jù)流行病學(xué)特征、臨診癥狀和剖檢病變，小鵝瘟一般不難作出診斷，但GP的發(fā)生特點(diǎn)已變得不典型，GP過去一般多發(fā)生于3周齡以下的雛鵝，現(xiàn)在其發(fā)病年齡有增大的趨勢，出現(xiàn)非典型或潛伏感染現(xiàn)象，常規(guī)診斷方法難以確診。GP的確診需借助實(shí)驗(yàn)室檢查，用于本病實(shí)驗(yàn)室診斷的方法有:病毒分離、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA、免疫熒光、中和試驗(yàn)、免疫電鏡、核酸探針和PCR等[9,13-15]。實(shí)驗(yàn)室診斷方法中，單抗介導(dǎo)的間接免疫熒光試驗(yàn)是檢測該病病原特異、簡便和快速的診斷方法,能在2h內(nèi)確診[7]。Zhang等（2010）利用重組VP3蛋白建立了VP3-ELISA，可以快速、特異檢測鵝GPV或番鴨MDPV感染抗體及監(jiān)測疫苗免疫抗體[16]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種簡單、快速(1～2h)、特異性強(qiáng)和耗費(fèi)低的核酸擴(kuò)增技術(shù)，可以在等溫條件下一步完成。Yang等(2010)成功建立可檢測臨床GPV感染的LAMP方法,該方法的檢測靈敏度達(dá)到28拷貝/μL[17]，具有較好的應(yīng)用前景。

近年來，水禽疫病呈上升趨勢，鵝的病毒性疾病除了小鵝瘟以外,又相繼出現(xiàn)了雛鵝新型病毒性腸炎、鵝副黏病毒病、鵝禽流感和鵝的鴨瘟等病，在臨床病例中既有單一感染,也有混合感染,需進(jìn)行鑒別診斷。鮮思美等（2009）建立了檢測DPV（鴨瘟病毒）、GPV（小鵝瘟病毒）、MDPV（番鴨細(xì)小病毒）和GPMV（鵝副黏病毒）等的基因芯片檢測方法，該方法對DPV、GPV、MDPV和GPMV的檢測具有同步檢測和鑒別診斷的功能[18]。

6 病毒的分子生物學(xué)

GPV分子生物學(xué)研究是新型疫苗研制和新診斷方法建立的基礎(chǔ)，近年來在此領(lǐng)域已取得重大進(jìn)展。

6.1 基因組結(jié)構(gòu) GPV病毒基因組DNA為單鏈、線性DNA,大小約5.0kb。GPV基因組中間為編碼區(qū)，兩端為回文序列折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即倒置末端重復(fù)序列 (ITR)。中間編碼區(qū)含有兩個(gè)開放閱讀框架(ORF)，但兩個(gè)ORF位于同一個(gè)讀碼框，左ORF(LORF)編碼NS1、NS2兩種非結(jié)構(gòu)蛋白，右側(cè)ORF(RORF)編碼 3 種結(jié)構(gòu)蛋白(VP)，即 VP1、VP2 和 VP3，其中VP3是主要衣殼蛋白，約占總蛋白的80%[5,18-19]。萬春和等（2011）采用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得1株鵝細(xì)小病毒株（GoPV）全基因序列(HQ891825)，該病毒全基因大小為5106 nt。GoPV株病毒全基因與歐洲疫苗株 VG32/1（EU583392）相似性最高，高達(dá) 98.6%；與匈牙利鵝細(xì)小病毒分離株Virulent B(U25479)相似性最低，為 93.6%[20]。GPV 全基因結(jié)構(gòu)見圖 3。

圖3 GPV基因組結(jié)構(gòu)

6.2 基因組開放閱讀框及編碼區(qū)的排布 GPV正鏈上有2個(gè)相距18nt開放閱讀框 (ORF)，基因組左側(cè)ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白。存在2個(gè)可能起始密碼子，第一個(gè)起始密碼子ATG位于537nt處，起始大的非結(jié)構(gòu)多肽NS1，第二個(gè)ATG位于1065nt處，起始第二個(gè)非結(jié)構(gòu)多肽NS2，NS1和NS2共同終止于2420nt處[20]。GPV3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白由位于基因組右側(cè)ORF編碼，位于 2439nt和3033nt處2個(gè)起始密碼子（ATG）分別起始VP1和VP3轉(zhuǎn)譯。推測VP2是由位于2874nt處不典型的起始密碼子ACG起始，這與MDPV、AAV-2的VP2相一致。3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白均終止于4637nt處的同1個(gè)TAA終止密碼子,在其右側(cè)的ITR 前有 1 個(gè) Poly（A）尾[18]。

6.3 倒置末端重復(fù)序列（ITR)GPV基因組的兩側(cè)各含有長444個(gè)核苷酸的倒置末端重復(fù) (ITR)[18,20]。ITR的3’，5’末端的407個(gè)核苷酸可折疊形成U形雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)中含有181個(gè)無錯(cuò)配“莖”部和44個(gè)堿基的“泡”區(qū)，形成了1個(gè)形似“箭”狀的結(jié)構(gòu)，在箭頭上有1個(gè)SphⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)（GCATGC）。在報(bào)道的鵝細(xì)小病毒基因中，ITR序列的長短有所不同（381～444nt）[21]。

6.4 病毒基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白 GPV基因組編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白，即VP1、VP2和VP3。已報(bào)道3種蛋白質(zhì)分子大小與由ORF推測的分子量略有不同，分別為 81.3～88 ku、60～72 ku 和 55～60 ku[16,21-22]。VP1、VP2和VP3蛋白多肽分別由732、587和534個(gè)氨基酸殘基組成[12]。桿狀病毒表達(dá)的GPV結(jié)構(gòu)蛋白在昆蟲細(xì)胞中能夠自組裝成病毒樣顆粒[23]。VP3是GPV主要免疫保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有中和作用的抗體，是用于構(gòu)建GPV基因疫苗的理想基因[24-25]。

7 疫苗研究

目前獲得注冊并取得生產(chǎn)文號的小鵝瘟疫苗主要有3種:小鵝瘟活疫苗（SYG26-35株，種鵝用）、小鵝瘟活疫苗（SYG41-50株，雛鵝用）和小鵝瘟活疫苗（GD株，種鵝用）。

7.1 小鵝瘟活疫苗（SYG26-35株） 1961年分離到小鵝瘟病毒（SYG61株）,SYG61株病毒連續(xù)通過易感鵝胚傳代14代后對成年鵝無致病力[3-4]。繼續(xù)在鵝胚上傳代至26～35代（SYG26-35）的毒種接種12日齡易感鵝胚用于制造種鵝用疫苗，免疫種鵝的后代雛鵝在3個(gè)月內(nèi)能抵抗小鵝瘟強(qiáng)毒的感染，保護(hù)率95%以上。1996年小鵝瘟活疫苗（SYG）獲得新獸藥證書。

7.2 小鵝瘟活疫苗（GD株） 陳伯倫等（1985）用廣東省小鵝瘟強(qiáng)毒株(GB)在鴨胚上連續(xù)傳代育成1株小鵝瘟鴨胚化GD弱毒株，用GD20-28代毒種接種8日齡鴨胚制備種鵝用疫苗。母鵝在產(chǎn)蛋前1個(gè)月注射疫苗后至母鵝270天（日齡）所產(chǎn)的蛋孵出的雛鵝,用強(qiáng)毒攻擊,其保護(hù)率達(dá)100%,270～312天內(nèi)出殼雛鵝,其保護(hù)率只達(dá) 82.8%～88.8%[8]。小鵝瘟活疫苗（GD株）已獲得新獸藥注冊。

7.3 小鵝瘟活疫苗（SYG41-50株） SYG61株病毒連續(xù)通過鵝胚20代之后對雛鵝無致病力[4]，繼續(xù)在鵝胚上傳代至41～50代（SYG41-50）的毒種接種12日齡易感鵝胚用于制造雛鵝用小鵝瘟疫苗。該疫苗適用于種鵝未經(jīng)免疫的后代雛鵝,或種鵝免疫時(shí)間較長的后代雛鵝作免疫預(yù)防。雛鵝出殼48小時(shí)內(nèi)皮下注射適當(dāng)稀釋的疫苗0.1mL（1羽份）。使用疫苗時(shí)間愈早愈好，免疫雛鵝1個(gè)月內(nèi)的保護(hù)率可達(dá)90%以上[1]。

在常規(guī)疫苗研究方面，其他研究者也進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)室研究。江美娟等（1984）將小鵝瘟病毒（SYG61）鵝胚繼代25代的毒株（YG25），再在鴨胚上連續(xù)繼代18代，獲得鴨胚化小鵝瘟弱毒株，其對1日齡的雛鵝無任何不良反應(yīng)，皮下注射免疫效果顯著[26]。陳少鶯等（2002）用發(fā)病的雛番鴨分離的鵝細(xì)小病毒莆田株(GPV-PT株，病毒對1日齡雛番鴨的發(fā)病率為100%,死亡率為80%)，在番鴨胚成纖維細(xì)胞(MDEFC)連續(xù)傳代25代，獲得鵝細(xì)小病毒弱毒疫苗株，用于1日齡雛番鴨免疫，7天后強(qiáng)毒攻擊,獲得100%保護(hù)[27]。程安春等（2005）將 GPV-CHv強(qiáng)毒株通過鵝胚5代，再經(jīng)10日齡鴨胚連續(xù)傳代15代,獲得GPV鴨胚化弱毒GPV-Cha15株，GPV-CHa15株用0.5 mL的劑量經(jīng)口服、皮下注射、肌肉注射、滴鼻和靜脈注射途徑免疫1日齡鵝后無任何不良反應(yīng)；GPV-CHa15株免疫雛鵝后第3天即可產(chǎn)生較為堅(jiān)強(qiáng)的免疫保護(hù)。母鵝免疫后第15天的后代雛鵝可100%抵抗強(qiáng)毒攻擊[11]。

7.4 新型疫苗研究

7.4.1 亞單位疫苗 Ju等（2011）利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中分別表達(dá)GPV結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3，它們能夠自組裝成病毒樣顆粒（VLPs），VLPs無感染性，但具有良好免疫原性，可作為重組亞單位疫苗[22-23]。GPV VLPs加入50%礦物油佐劑免疫4日齡雛鵝能產(chǎn)生高滴度的中和抗體，抗體滴度高于滅活疫苗和活疫苗[22]。Lee等（2010）利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中分別表達(dá)GPV結(jié)構(gòu)蛋白VP2，0.3%二乙烯亞胺（BEI）滅活，以氫氧化鋁或 CpG ODNs為佐劑，免疫9日齡鴨，首次免疫后14天進(jìn)行二次免疫，產(chǎn)生良好抗體應(yīng)答[28]。

7.4.2 基因工程疫苗 朱德康等（2011）比較小鵝瘟病毒（GPV）VP3基因疫苗（pcDNA-GPV-VP3）和弱毒疫苗免疫鵝的免疫應(yīng)答，結(jié)果表明，pcDNA-GPVVP3免疫雛鵝后能在免疫部位皮膚、心肌和各腸段中表達(dá)并能夠誘導(dǎo)鵝體產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫和體液免疫，基因疫苗免疫鵝血清抗體從第14天開始升高，第28天達(dá)最大值，第217天仍然顯著高于對照組，基因疫苗誘導(dǎo)鵝體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力與弱毒疫苗相當(dāng)[24]。于志丹等（2008）將GPV-VP3基因和GPMVF基因插入到禽痘病毒基因組的復(fù)制非必需區(qū),成功構(gòu)建了重組雞痘病毒rFPV-VP3-F[25]，但其在鵝上的免疫效率試驗(yàn)還未見報(bào)道。

8 預(yù)防與治療

8.1 種鵝免疫 根據(jù)小鵝瘟的流行規(guī)律,免疫種鵝使其后代雛鵝從母鵝體獲得天然被動免疫力(即母源抗體)是主要的途徑，即在產(chǎn)蛋前15～30天,以小鵝瘟活疫苗給種鵝行肌肉注射(1羽份，1mL/只)。從注射疫苗后12～100天,母鵝所產(chǎn)的種蛋孵出的雛鵝,均可獲得抵抗小鵝瘟病毒的堅(jiān)強(qiáng)抵抗力[1,3]。種鵝在產(chǎn)蛋前30天內(nèi)進(jìn)行2次活疫苗免疫（間隔2周），雛鵝的保護(hù)期可延長至免疫后5個(gè)月。

8.2 雛鵝免疫 來源于非免疫種鵝群或免疫后期種群孵化的雛鵝，在出殼后48h內(nèi)，應(yīng)用小鵝瘟活疫苗（SYG41-50株）進(jìn)行免疫，免疫后7天內(nèi)嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)，防止強(qiáng)毒感染。已感染發(fā)病的雛鵝進(jìn)行免疫注射無明顯預(yù)防效果[1]。

需要注意的是小鵝瘟主要通過污染孵坊傳播，因此孵坊中的一切用具和設(shè)備在每次使用后，必須清洗消毒。種蛋入孵前需清除表面污染物，用福爾馬林熏蒸消毒，盡量不要從疫區(qū)引進(jìn)種蛋和雛鵝。

8.3 治療 抗小鵝瘟血清或精制高免卵黃抗體用于疫區(qū)初生雛鵝緊急預(yù)防和患病雛鵝早期治療,效果極佳。抗血清或卵黃抗體的瓊擴(kuò)效價(jià)應(yīng)在1∶8以上[1]。在小鵝瘟威脅地區(qū)，出殼后24h內(nèi)的雛鵝,每只皮下注射0.3～0.5mL，其保護(hù)率達(dá)95%以上；緊急預(yù)防時(shí)，0.5～0.8mL/只皮下注射，保護(hù)率達(dá) 90%左右；對已發(fā)病雛鵝，1mL/只皮下注射，治愈率有 40%～50%[4]；1 月齡以上的病鵝，注射2mL/只，能夠控制和撲滅本病的流行。另外可在日糧中加一些抗菌藥（環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素等）以防止繼發(fā)感染，在飲水中加5%葡萄糖及0.05%維生素C增強(qiáng)其抵抗力[29]。

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