正交法研究云南粗根蕁麻多糖的提取條件

李仲昆 王崇靜 王珩 尹為民

正交法研究云南粗根蕁麻多糖的提取條件

李仲昆 王崇靜 王珩 尹為民

目的研究提取和測(cè)定云南粗根蕁麻多糖的方法。方法用正交法對(duì)云南粗根蕁麻多糖的提取條件進(jìn)行研究，用硫酸-苯酚比色法對(duì)多糖的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果粗根蕁麻水提物、粗多糖、精制多糖的多糖含量分別為12.3%、30.4%、42.7%。結(jié)論提取和測(cè)定粗根蕁麻多糖的方法簡(jiǎn)便易行，穩(wěn)定可靠。

云南粗根蕁麻;正交設(shè)計(jì);多糖

蕁麻屬(Urtica L.)植物全世界約35種，主要分布于北半球溫帶和亞熱帶，中國(guó)約有23種。蕁麻、寬葉蕁麻在我國(guó)廣泛分布，齒葉蕁麻、新疆蕁麻、甘肅蕁麻、粗根蕁麻為我國(guó)特有品種，而粗根蕁麻主分布于云南。蕁麻屬多種植物均可藥用，多以全草入藥，少數(shù)地方藥用根及根莖(稱蕁麻根)，有祛風(fēng)通絡(luò)、活血止痛、平肝定驚、消積通便、解毒等功效［1］。

國(guó)外對(duì)大蕁麻和異株蕁麻進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)其可以用來(lái)治療前列腺增生、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏性鼻炎、皮膚病、高血壓、心臟病、糖尿病，并且具有抗病毒及免疫調(diào)節(jié)活性。

我國(guó)目前尚無(wú)成型產(chǎn)品，雖然有相關(guān)研究［2-4］，但是對(duì)云南特有的粗根蕁麻少見(jiàn)研究，因此有必要加強(qiáng)研究。

1 儀器與材料

UV-2401型紫外分光光度計(jì)(日本島津);FA-2004型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);離心機(jī);旋渦振蕩儀;超聲振蕩儀;HH.S型電熱恒溫水浴鍋(江蘇省醫(yī)療器械廠)。石油醚，乙酸乙酯，鞣酸，無(wú)水乙醇，苯酚，濃硫酸均為分析純。D-無(wú)水葡萄糖(中國(guó)生物制品檢定所，0833-9501)。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交設(shè)計(jì)確定粗根蕁麻葉提取工藝 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料，以加水量，煮沸時(shí)間，浸泡時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，每個(gè)因素分為3個(gè)水平，見(jiàn)表1。(每份樣品的粗根蕁麻葉重量為2 g)

表1 因素水平表

根據(jù)表1選擇L9(34)正交表實(shí)施實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2，3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)與結(jié)果L9(34)

表3 方差分析表

根據(jù)方差分析的結(jié)果，B因素各水平間都有顯著性差異，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響的大小，可用該因素各水平的極差R表示，這是由于正交表具有搭配均勻的特性，A列上的K1，K2，K3的差異可認(rèn)為主要由A列上的不同水平引起的;同樣，B列，C列上的差異也可認(rèn)為主要是由B列，C列上的不同水平引起的。因此，某因素的極差大，就表明該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)影響大。根據(jù)分析的結(jié)果，因素的主次順序?yàn)锽＞C＞A。條件為B3A1C1。

2.1.1 粗根蕁麻葉提取 以加水量1000 m l，煮沸時(shí)間1 h，不浸泡，將100 g粗根蕁麻葉進(jìn)行提取，將提取液濃縮干燥后得粗根蕁麻干品15.6 g，收率為15.6%。

2.1.2 正交設(shè)計(jì)確定粗根蕁麻桿提取工藝 以加水量，煮沸時(shí)間，浸泡時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，每個(gè)因素分為3個(gè)水平，見(jiàn)表4。(每份樣品的粗根蕁麻桿重量為2 g)

表4 因素水平表

根據(jù)表1選擇L9(34)正交表實(shí)施實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5，6。

表5 正交實(shí)驗(yàn)與結(jié)果L9(34)

表6 方差分析表

根據(jù)方差分析的結(jié)果，B因素各水平間都有顯著性差異.各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響的大小，可用該因素各水平的極差R表示.這是由于正交表具有搭配均勻的特性，A列上的K1，K2，K3的差異可認(rèn)為主要由A列上的不同水平引起的;同樣，B列，C列上的差異也可認(rèn)為主要是由B列，C列上的不同水平引起的。因此，某因素的極差大，就表明該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)影響大。根據(jù)分析的結(jié)果，因素的主次順序?yàn)锽＞A＞C。條件為B3A1C1。

2.2 2粗根蕁麻桿提取率 以加水量1000 ml，煮沸時(shí)間1 h，不浸泡，將100 g粗根蕁麻桿進(jìn)行提取，將提取液濃縮干燥后得粗根蕁麻干品9.5 g，收率為9.5%。

2.3 粗根蕁麻提取液的含量測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖30 mg，置50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 ml中含無(wú)水葡萄糖0.6 mg)。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml，分別置25 ml量瓶中，各加水至刻度，搖勻。分別精密量取上述液1.0 ml，置具塞試管中，各加4%苯酚溶液1.0ml，混勻，迅速加入硫酸7.0ml，搖勻，置75℃水浴中保溫30 min，取出后冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白。照分光光度法(附錄VB)，在490nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，經(jīng)計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線C=15.169311A-0.06653。

經(jīng)計(jì)算，r=0.999123，線性關(guān)系良好。

2.3.3 粗根蕁麻提取液的含量測(cè)定 稱取粗根蕁麻粉末2.0 g，按照表2的條件進(jìn)行試驗(yàn)，煮沸后的樣品加水到原始重量后，將上層液倒入10 ml試管，離心5.0 min(3000r/min)，取上清夜3.0 ml加3.0 ml石油醚，旋渦振蕩1 min，超聲10 min，離心5 min，取下層液2.0 ml加入3.0 m l乙酸乙酯，旋渦振蕩1 min，超聲10 min，離心5 min。取下層液1.0 m l加1%鞣酸5.0 ml，水浴煮沸5 min，加入活性炭適量，煮沸5 min，離心，取上清液1.0 ml加入95%乙醇6.0 ml，于箱冷藏20 h，離心，棄去上清液，殘?jiān)?5%乙醇8 m l洗滌，離心，棄去上清液，揮干乙醇。殘?jiān)?.0 ml蒸餾水，振蕩溶解，取1.0 ml加入4%苯酚1.0 ml，混勻后，緩慢加入7.0 ml濃硫酸，振蕩，超聲10 min，放入75℃水浴中加熱30 min，冷卻至室溫后在490nm處測(cè)定吸收度。將A值代入回歸方程計(jì)算，求出提取物含多糖的量。

2.4 粗根蕁麻水提物、粗多糖、精制多糖的制備 水提物的制備方法為將干燥后的粗根蕁麻桿、葉粉碎后，經(jīng)過(guò)2次水提取，合并提取液，干燥后即得，一般可以得到10%的干燥品，即1 g相當(dāng)于10 g生藥，測(cè)定后含多糖為12.3%。

粗多糖的制備方法為，將干燥的水提物25 g，加水70 ml溶解，加95%乙醇350 ml，攪拌，傾去上層液體。沉淀加水50 ml溶解，加95%乙醇250 ml，攪拌，傾去上層液體，沉淀干燥后即得。可得9 g粗多糖，即1 g相當(dāng)于28 g生藥，測(cè)定后含多糖為30.4%。

精制多糖的制備方法為，將干燥的水提物25 g，加水70 ml溶解，加95%乙醇350 ml，攪拌，傾去上層液體。沉淀加水50 ml溶解，加95%乙醇250 m l，攪拌，傾去上層液體，此操作再重復(fù)2次，沉淀干燥后即得?？傻?.5 g精制多糖，即1 g相當(dāng)于38 g生藥，測(cè)定后含多糖為42.7%。

［1］李蓉，秦民堅(jiān)，余國(guó)奠.蕁麻屬藥用植物研究概況及其開(kāi)發(fā)價(jià)值.中國(guó)野生植物資源，2003，21(1):24-26.

［2］王夢(mèng)月，李外，李曉波.蕁麻水溶性化學(xué)成分研究.中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40(24):1853-1855.

［3］劉悅秋，孫向陽(yáng).異株蕁麻的活性成分及開(kāi)發(fā)利用.國(guó)外醫(yī)學(xué).中醫(yī)中藥分冊(cè)，2005，27(3):144-148.

［4］王月夢(mèng)，衛(wèi)瑩芳，史炎.蕁麻多糖藥理作用研究.中藥材，2001，24(9):666-667.

Orthogonal design study the extraction conditions of Yunnan Urtica Macrorrhiza Hand-Mazz polysaccharide

LIZhong-kun，WANGChong-jing，WANGHeng，et al.

Yan'an Hospital of Kunming，Yunnan Kunming 650051，China

ObjectiveTo study themethods of extraction and determination Yunnan Urtica Macrorrhiza Hand-Mazz polysaccharide.MethodsTo study the extraction conditions of Yunnan Urtica Macrorrhiza Hand-Mazz polysaccharidewith orthogonal design.The polysaccharide was determined by colourimetry with sulfuric acid-phenol as colourimetric resgent.ResultsYunnan Urtica Macrorrhiza Hand-Mazz aqueous extracts，polysaccharide，purification of the polysaccharide contents are respectively 12.3%，30.4%，42.7%.ConclusionExtraction and determination of Yunnan Urtica Macrorrhiza Hand-Mazz polysaccharidemethod is simple，stable and reliable.

Yunnan Urtica Macrorrhiza Hand-Mazz;Orthogonal design;Polysaccharide

云南省科技計(jì)劃面上項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):2008ZC147M)

650051 昆明市延安醫(yī)院(李仲昆 王崇靜 王珩);云南省第一人民醫(yī)院(尹為民)

尹為民