龍膽內生菌的分離鑒定及其對蘋果腐爛病菌的拮抗作用

黃海東，李曉雁，楊紅澎，盧顯芝，韓 影

（天津農學院農學系，天津 300384）

龍膽內生菌的分離鑒定及其對蘋果腐爛病菌的拮抗作用

黃海東，李曉雁，楊紅澎，盧顯芝，韓 影

（天津農學院農學系，天津 300384）

從云霧龍膽中分離到內生菌LD－b1，通過形態觀察、生理生化實驗和16S rDNA系統進化分析，鑒定其為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。該菌株的發酵上清液對蘋果腐爛病菌的生長有顯著的拮抗作用，拮抗活性物質對80℃以下的溫度有一定耐受能力;在pH 5～10之間均有一定活性，對低pH更敏感;50μg/mL的蛋白酶K在37℃條件下處理1h可以使其抑菌活性完全喪失。抑菌曲線測定結果表明，搖瓶發酵48h時內生菌LD－b1的抑菌活性最高，在蘋果果實上對腐爛病斑也具有明顯的抑制作用。

龍膽，內生菌，蘋果腐爛病菌，拮抗作用

蘋果腐爛病俗稱爛皮病，是一種對蘋果危害嚴重的病害，而且越靠北部寒冷地區越嚴重，目前防治蘋果腐爛病多采用化學試劑，雖然見效快、防治效果好，但長期使用化學殺菌劑不但會導致病菌對其產生抗藥性［1－2］，而且蘋果上殘留的化學藥劑也會對公眾健康造成威脅并污染環境，為此，各國科學家都在積極探索能代替化學農藥的防病新技術［3］。植物內生菌（endophyte）是指生活在植物活組織內而不引起任何直接和明顯植物病變的一大類微生物，包括寄生或共生在植物體內的真菌和細菌。植物內生細菌是植物病害生物防治的天然資源菌，具有廣闊的理論研究價值和開發應用前景［4－5］。云霧龍膽（Gentiana nubigena）是龍膽科龍膽屬的植物，具有抗炎、利膽等作用［6］，本文對云霧龍膽內生菌進行了分離鑒定，研究了內生菌對蘋果腐爛病菌的抑制效果，并對抑菌活性成分性質進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云霧龍膽 由青海省藏醫藥研究院藥物研究所提供;蘋果腐爛病菌（Valsa mali Miyabe et Yamada）

由天津農學院園藝系田小衛博士提供;改良馬丁培養基 蛋白胨5g，葡萄糖20g，酵母粉2g，K2HPO41g，MgSO40.5g，蒸餾水1000m L，pH 6.4±0.2;篩選培養基1 蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，云霧龍膽浸提液1m L，瓊脂15g，蒸餾水1000m L，pH 7.0～7.5;篩選培養基2 馬鈴薯200g，葡萄糖20g，云霧龍膽浸提液1m L，瓊脂15g，蒸餾水1000m L，pH 7.0～7.5;發酵培養基 蔗糖30g，蛋白胨2g，K2HPO40.3g，NaCl 0.1g，蒸餾水1000m L，pH 7.0～7.5;UNIQ－10試劑盒，pGEM－T Easy載體 Promega公司。

Biofuge型高速冷凍離心機 Heraeus公司; Tgradient型PCR儀 Biometra公司;DYY－6B型電泳儀和WD－9403F型紫外分析儀 北京六一儀器廠;LRH－150B型生化培養箱 廣東醫療器械廠; HYG－III回旋式搖床 上海新蕊公司;HH－Z4型恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿公司;752型紫外光柵分光光度計 上海精密科學儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 龍膽內生菌的分離 取一段云霧龍膽的莖，無菌水沖洗2次，用無菌濾紙吸干水分;在70%乙醇溶液中浸泡2m in，再用0.1%升汞浸泡30s，無菌水沖洗3次。在無菌條件下用刀片將外皮削去，并截成1cm左右的小段，置于篩選培養基表面，30℃培養4～8d。待平板有菌長出后，平板劃線純化，直至得到單菌落，斜面保存備用。

1.2.2 內生菌發酵液的制備 250m L三角瓶裝100m L發酵培養基，接種后置于旋轉式搖床上，180r/min、30℃培養48h，發酵液在6000 r/m in下離心10m in，取上清液用于抗菌活性測定。

1.2.3 抗菌活性測定 將蘋果腐爛病菌活化和擴大培養，稀釋制成106孢子/m L的懸液，取0.2m L孢子懸液與滅菌改良馬丁培養基15m L混合制成平板，凝固后，用滅過菌的1cm直徑打孔器在每個平板上打孔，除去孔內瓊脂并向孔中加入0.1m L發酵上清液，以無菌蒸餾水和云霧龍膽浸提液［7］為對照，28℃培養4d后，測量抑菌圈直徑。為了確保結果的準確性，每平板設3個重復。

1.2.4 龍膽內生菌的分類鑒定

1.2.4.1 形態特征 取固體平板上培養48h的菌株進行革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色，觀察內生菌的形態特征。

1.2.4.2 生理生化特征 氧化酶、接觸酶、H2S產生、吲哚、硝酸鹽還原、脲酶等實驗參考文獻［8］進行。

1.2.4.3 16S rDNA序列測定及系統進化分析 將菌株LD－b1于30℃培養24h，離心后，用0.5mol/L NaCl洗1次，用1mg/m L溶菌酶溶液懸浮菌體，37℃作用30min，用UNIQ－10試劑盒提取細菌基因組DNA。以菌株LD－b1的基因組DNA為模板，用細菌16S rDNA通用引物27F（5'－GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'）和1541R（5'－AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3'）擴增得到目的基因片段，經瓊脂糖凝膠電泳純化后與pGEM－T Easy載體連接，轉化E.coli DH5a，用X－gal平板篩選含有插入DNA片段的白色轉化子，經限制性內切酶酶切鑒定后送北京華大公司測序。將得到的16S rDNA序列與 GenBank中的核酸數據進行BLAST比對，搜索得到與其同源性最高的相關序列，采用軟件Clustal X1.8對所獲得的核苷酸序列進行分析，得到序列之間的相似值;用軟件MEGA2.0計算出序列的系統進化距離，采用鄰位相連法構建系統進化樹［9］。

1.2.5 抑菌活性曲線的測定 將內生菌LD－b1種子液按照2%的接種量接入100m L液體培養基，30℃，180r/min振蕩培養，每隔6h取樣，測定OD600光吸收值，并取上清液進行抗蘋果腐爛病菌的活性檢測。

1.2.6 溫度、pH、蛋白酶對抗菌物質活性的影響 內生菌發酵液在8000 r/m in條件下離心15m in后，上清液經0.22μm濾膜過濾后，分別作以下處理:a.分別經20、40、60、80、100℃處理1h和121℃處理30m in; b.將pH分別調至4.0～11.0;c.加入蛋白酶K，使其終濃度達到50μg/m L，37℃水浴0.5、1、2、4h。經上述處理后測定抗蘋果腐爛病菌的活性，每處理重復3次。

1.2.7 在蘋果果實上的抑菌實驗 將紅富士蘋果用70%酒精消毒，晾干后，用接種針在蘋果上刺一個6mm（深）×4mm（直徑）的傷口，分別加入200μL的LD－b1發酵上清液和無菌水，2h后分別接種105孢子/m L的蘋果腐爛病菌200μL，將果實放于果盤中，果盤用保鮮膜包裹，25℃放置，一周后觀察結果。

2 結果與分析

2.1 龍膽內生菌的分離及抗菌效果測定

從云霧龍膽中分離得到多株內生細菌，制備內生菌發酵液，以無菌水為陰性對照，云霧龍膽提取液［7］為陽性對照，用混菌瓊脂平板打孔法測定抑菌活性。結果篩選到一株龍膽內生細菌LD－b1，其發酵上清液能明顯抑制平板上蘋果腐爛病菌的生長（圖1），而龍膽提取液也有一定的抑菌作用。

圖1 菌株LD－b1對蘋果腐爛病菌的抑制作用Fig.1 Antibiotic activity toward V.mali of strain LD－b1

2.2 菌株LD－b1的分類鑒定

2.2.1 形態特征 在固體平板上30℃培養1d，菌株LD－b1形成乳白色不透明菌落，菌落近似圓形，邊緣不整齊，中間有小突起，直徑0.6～1.1cm，不分泌色素;LD－b1菌體細胞為短桿狀，大小0.5～0.6μm× 1.5～2.1μm，革蘭氏陽性，有芽孢。

2.2.2 生理生化特性 菌株LD－b1好氧生長，生長的溫度范圍為8～50℃，pH范圍5.5～8.5，NaCl濃度范圍0～7%;能夠利用的碳源有:葡萄糖、蔗糖、乳糖、樹膠醛糖、木糖、半乳糖、甘露醇、N－乙酰－葡糖胺、葡糖酸鹽;不能利用淀粉、糊精、蜜二糖、鼠李糖和山梨醇。其他生理生化指標的實驗結果如表1所示。

2.2.3 16S rDNA序列測定及系統進化分析 PCR擴增得到菌株LD－b1的16S rDNA片段，經DNA測序長度為1444bp，在GenBank/EMBL/DDBJ中的序列登記號為JF932295。將16S rDNA序列與GenBank數據庫中的序列進行 BLAST比對，結果表明菌株LD－b1與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）的同源性較高，且與 Bacillus pum ilus KNUC389和 Bacillus pum ilus KNUC235的同源性最高，分別為達到 99.8%和99.7%。將其與芽孢桿菌屬9個相近的種進行遺傳距離計算，用鄰位相連法構建系統進化樹（圖2），可以看出，菌株 LD－b1與短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）劃分在同一簇內，結合形態學和生理生化特征指標，確定云霧龍膽內生菌LD－b1為短小芽孢桿菌。

表1 菌株LD－b1的生理生化特征Table 1 Physio－biochemical characteristics of strain LD－b1

圖2 菌株LD－b1的16S rDNA序列系統進化樹Fig.2 Phylognetic tree of LD－b1 16S rDNA sequences

2.3 內生菌LD－b1對蘋果腐爛病菌的抑菌曲線

由圖3中內生菌LD－b1的細胞生長曲線可以看出，培養48h的OD600最大，之后進入衰亡期;而抑菌圈直徑也隨著內生菌的生長而變大，在36～48h之間LD－b1的抑菌活性最大，說明后期研究中，應該將搖瓶發酵周期控制在此時間段內。

圖3 菌株LD－b1對蘋果腐爛病菌的抑菌活性曲線Fig.3 Antibiotic activity curve toward V.mali of strain LD－b1

2.4 溫度、pH、蛋白酶K對抗菌物質活性的影響

內生菌LD－b1的無菌濾液經不同溫度處理后進行抑菌活性檢測，由圖4可以看出，抗菌物質對熱有一定的耐受能力，20℃的抑菌活性與對照（發酵液不經熱處理）相同，40℃處理1h后樣品抑菌活性為對照樣品的91%，100℃以上的處理后樣品無抑菌活性。

由圖5可知，菌株LD－b1產生的抗菌物質對低pH更敏感，對偏堿環境有一定的耐受能力。在pH為8時抗菌活性降低22.5%，pH為9時抗菌活性降低48.7%，在pH小于4或大于11的條件下，抗菌活性完全喪失。

圖4 溫度對胞外抗菌物質活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the antibiotic activity of extracellularmetabolite

圖5 pH對胞外抗菌物質活性的影響Fig.5 Effect of pH on the antibiotic activity of extracellularmetabolite

在樣品中加入蛋白酶K，30℃處理30m in后，抑菌圈直徑減少為對照的38.9%，處理時間大于1h，則抑菌活性完全消失，結合其對溫度和pH的穩定性實驗結果，判斷內生菌LD－b1產生的抗菌成分為蛋白類物質。

2.5 內生菌LD－b1在蘋果果實上的抑菌效果

從圖6可以看出，內生菌LD－b1產生的抑菌物質能夠顯著地抑制蘋果腐爛病菌對果實的侵蝕。接種病菌后室溫放置 6d，對照果實的病斑直徑為17.5mm，LD－b1樣品處理后果實的病斑直徑為2.4mm，僅為對照的13.7%。

圖6 不同處理蘋果的病斑Fig.6 Decay lesion of apples after different inoculation

3 結論

中藥內生菌能產生具有抗菌等多種活性的代謝產物，是植物病害生物防治的重要微生物資源。目前，對蘋果腐爛病的生防研究主要使用放線菌中的鏈霉菌屬和內生真菌，內生細菌對該種病害拮抗作用的報道相對較少［10－11］。芽孢桿菌屬是常見的內生細菌種類，可以產生桿菌肽、環脂、氨基酸類、核酸類、類噬菌體顆粒等多種抗菌物質，能抑制多種植物及人類病原菌［12］;而且芽孢桿菌具有生長快、營養簡單、抗逆性強等優點，非常適合開發成防菌劑。本研究從云霧龍膽中分離篩選到一株對蘋果腐爛病菌有顯著拮抗作用的內生菌:短小芽孢桿菌LD－b1。該菌株產生的抗菌成分為蛋白類物質，搖瓶發酵48h的抗菌活性最強，在蘋果果實上對腐爛病斑也具有明顯的抑制作用，說明其在蘋果腐爛病菌防治方面有很好的應用前景。該菌株產生抗菌物質的發酵條件優化、環境安全評估等仍有待進一步的深入研究。

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Identification of endophyte from Gentiana nubigena and antagonism on the Valsa mali

HUANG Hai－dong，LIXiao－yan，YANG Hong－peng，LU Xian－zhi，HAN Ying

（Department of Agronomy，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）

Endophytic strain LD－b1 was isolated from Gentiana nubigena.Accord ing to the characteristics of morphology，physiology and biochem istry tests and the com parison of 16S rDNA sequence，strain LD－b1 was identified as Bacillus pum ilus.The fermentation broth of LD－b1 showed antagonism activities against Valsamali.The antibiotic active substance was stab le to the tem perature lower than 80℃，and the pH range from 5 to 10，butmore suscep tib le to lower pH.The antifung la activity lost under the treatmentw ith 50μg/m L p roteinase K in the cond itions of 37℃ longer than 1h.The results of shaking flask fermentation curves showed antibiotic ac tivities reached the maximum at48h.The lesion d iameter was smaller obviously when app le fruits were treated w ith LD－b1.

Gentiana;endophyte;Valsa m ali;antagonism

TS201.3

A

1002－0306（2012）06－0215－04

2011－06－01

黃海東（1972－），男，副教授，主要從事資源細菌及工程方面的研究。

天津市高等學校科技發展基金（20100604）;天津市科委基礎重點項目（11JCZDJC16600）。