響應面法優化藍莓葉抑菌物質的提取工藝

胡 筱，李春陽，周 濤，*

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇南京210097; 2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京 210014）

響應面法優化藍莓葉抑菌物質的提取工藝

胡 筱1，李春陽2，周 濤1，*

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇南京210097; 2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京 210014）

在單因素實驗基礎上，采用響應面法優化藍莓葉抑菌物質的最佳提取工藝，實驗結果為:乙醇體積分數85.00%、提取溫度66℃、液料比9.2∶1（mL/g），在此條件下藍莓葉提取物抑菌效果最好，抑菌圈直徑平均值達18.07mm。

響應面法，藍莓葉，抑菌，提取工藝

藍莓，又稱越橘，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）多年生落葉或常綠灌木［1］。分布于中國、俄羅斯、歐洲、北美、日本、朝鮮等北半球高緯度國家［2］。藍莓作為一種藥食兩用植物，以葉入藥，性溫、味苦，有利尿、消炎、解毒之功效，并可用于風濕、痛風的治療。藍莓葉中含有豐富的黃酮類、原花青素、花色苷類等多種多酚類生理活性成分，還富含多種微量元素［3］。植物多酚能與生物大分子如蛋白質、多糖結合，并能與金屬離子發生絡合反應，對微生物具有抑制作用［4］。對于藍莓的研究，大多局限于對其果實營養成分、藥用成分的測定，而對藍莓葉的應用和研究較少。目前國內外對藍莓葉的研究主要集中在活性物質的提取純化、黑色素的穩定性及其生理功能［5－10］方面，對于藍莓葉提取物抑菌作用的研究較少。本實驗采用響應面法（RSM）［11］優化藍莓葉抑菌物質的提取工藝，旨在為藍莓葉資源的利用及天然抑菌劑的開發提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓葉 采自南京市溧水傅家邊農業科技觀光園;大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus） 南京師范大學食品微生物實驗室;培養基 牛肉膏蛋白胨培養基;無水乙醇、氫氧化鈉、瓊脂、氯化鈉 均為分析純;牛肉膏、蛋白胨 均為生化試劑。

YXQ－LS－SII型高壓滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;LD5－10型低速離心機 北京醫用離心機廠;N－1001型旋轉蒸發儀 上海愛郎儀器有限公司;SW－CJ－IF型無菌超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;DHG－9140型電熱恒溫鼓風干燥箱上海精宏實驗設備有限公司;CHA－S氣浴恒溫振蕩培養箱 蘇州江東精密儀器有限公司;722N可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓葉提取物的制備 藍莓葉經60℃干燥后粉碎過篩，稱取藍莓葉粉末5g，加入提取劑，在一定溫度下冷凝回流，真空抽濾，4000r/min離心8min，取上清液旋轉蒸發濃縮至5m L原液（此處原液指1m L提取液中含有1g原材料的提取物，即1g/m L），原液經0.2μm微孔除菌膜過濾除菌后，4℃條件下保存備用。

1.2.2 菌懸液的制備 在無菌條件下，將供試菌種接種到牛肉膏蛋白胨斜面培養基上，37℃培養24h，挑取菌落，用無菌生理鹽水稀釋，獲得6～7 lgCFU/m L的菌懸液，備用［12］。

1.2.3 提取物抑菌作用的測定 采用打孔法測定提取液抑菌作用。吸取適宜體積分數的菌懸液0.1m L加入平皿中，倒入溫度冷卻至50℃左右的培養基約15m L后搖勻;待培養基凝固后，用打孔器在平板上打出三個直徑為6mm的圓孔，向圓孔中加入50μL提取液，每個菌種每種提取物做三組平行，另以試樣含同樣體積分數的乙醇為空白對照。平皿放置于37℃下培養24h后，用游標卡尺量取抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑大小作為衡量提取液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌活性的指標。

1.2.4 單因素實驗 以兩種菌種抑菌圈直徑的平均值為指標，研究乙醇體積分數、提取溫度、液料比和提取時間四個因素的影響規律。

1.2.5 響應面實驗方案 根據單因素實驗結果設定因素水平，采用 Design Expert 7.0軟件的 Box－Behnken實驗設計原理［13］，選取影響抑菌物質提取率的3個主要因素:乙醇體積分數、提取溫度和液料比進行響應面優化組合，因素水平設計見表1。

表1 Box－Behnken實驗設計因素水平及編碼Table 1 Factors and coded levels in the Box－Behnken experimental design

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對提取物抑菌效果的影響 在液料比10∶1（m L/g），溫度60℃，時間6h的提取條件下，隨著乙醇體積分數的提高，藍莓葉抑菌物質的提取率也隨之增大。但當乙醇體積分數達到80%以上時，抑菌效果隨乙醇體積分數的增加而減弱（見圖1）。這可能是由于一些醇溶性雜質、色素、親脂性強的成分增大溶出，干擾因素增大，從而導致抑菌物質的提取率下降。

2.1.2 提取溫度對提取物抑菌效果的影響 在液料比10∶1（m L/g），乙醇體積分數80%，時間6h的提取條件下，隨著提取溫度的升高，藍莓葉抑菌物質的提取率先增后減（見圖2）。在溫度60℃時，提取物的抑菌活性達到最高值，繼續增加提取溫度，抑菌活性反而下降。溫度過高，活性物質的結構會遭到破壞;另一方面也會造成溶劑的損失和成本費用增加。

圖1 乙醇體積分數對抑菌效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on antibacterial activity of the extract

圖2 提取溫度對抑菌效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on antibacterial activity of the extract

2.1.3 液料比對提取物抑菌效果的影響 在乙醇體積分數80%，溫度60℃，時間6h的提取條件下，隨著液料比的升高，藍莓葉抑菌物質的提取率也隨之增大（見圖3）。液料比10∶1（m L/g）時，藍莓葉提取物的抑菌活性最強。繼續增大液料比，抑菌活性變化不大。前期溶劑量大，可以增加物料與溶劑的接觸面積，有效成分浸出更加完全，當液料比達到一定的比例時，提取劑中抑菌物質的溶解度基本達到飽和，此時再增大液料比會造成溶劑和能源的浪費，并使進一步的濃縮時消耗更多的能量和時間。

圖3 液料比對抑菌效果的影響Fig.3 Effect ofmaterial－to－liquid ratio on antibacterial activity of the extract

2.1.4 提取時間對提取物抑菌效果的影響 在液料比10∶1（m L/g），乙醇體積分數80%，溫度60℃的提取條件下，隨著提取時間的增加，藍莓葉抑菌物質的提取率也隨著增大（見圖4）。但當提取時間達到6h以上時，抑菌效果隨提取時間的增加而減弱。表明提取時間在1～6h時，物料與溶劑接觸越來越充分，體積分數差也較大，擴散速度快，加速了有效抑菌成分的浸出［14］。隨著時間延長，增加了非抑菌成分的浸出，同時抑菌成分可能也受到了破壞。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

圖4 提取時間對抑菌效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on antibacterial activity of the extract

2.2 響應面優化實驗

2.2.1 響應面設計結果與分析 按表1因素與水平設計實驗方案，實驗結果見表2。

表2 響應面法設計與實驗結果Table 2 Experimental design and results of the Box－Benhnken test

2.2.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗 利用Design－Expert 7.0軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到乙醇體積分數（X1）、提取溫度（X2）、液料比（X3）的二次多項回歸模型:

對該模型進行方差分析，結果見表3，回歸模型系數顯著性檢驗，結果見表4。

從表3可見，對藍莓葉抑菌物質提取所建立的回歸模型差異極顯著（P＜0.0001），說明該回歸方程因變量和全體自變量的相關關系是顯著的，即這種實驗方法是可靠的。失擬項P＞0.05，差異不顯著，說明可以用該回歸方程對不同提取條件下的抑菌物質的提取效果進行檢測。復相關系數R2=0.9772，說明該模型能解釋97.72%響應者的變化，即該模型與實際實驗擬合良好，實驗誤差小。校正決定系數R2Adj=0.9478，說明該回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系。另外，該模型的變異系數為1.50%，數值較低，說明該實驗重復性好［15］，可靠性強。該模型的RSN（信噪比）為17.568，遠大于4，說明用此模型可以得到足夠強的響應信號。由此可知，回歸方程的擬合度和可信度均很高，能夠很好地對藍莓葉中抑菌物質的提取進行預測。

由表4可以看出，乙醇體積分數和提取溫度的交互作用、提取溫度的二次項和液料比的二次項對抑菌效果有極顯著影響（P＜0.01）;乙醇體積分數、提取溫度和液料比的一次項以及提取溫度和液料比的交互作用對抑菌效果有顯著影響;乙醇體積分數和提取溫度的交互作用、乙醇體積分數的二次項影響不顯著。表明乙醇體積分數、提取溫度和液料比對藍莓葉抑菌物質的提取影響顯著，并且乙醇體積分數和提取溫度、提取溫度和液料比之間存在交互作用。由3個因素的F值大小可知，對藍莓葉抑菌物質的提取效果影響的顯著性順序依次為液料比＞提取溫度＞乙醇體積分數。

2.2.3 響應面分析與優化 根據回歸模型作出兩因素交互作用的響應曲面及其等高線圖，結果見圖5～圖7。如果一個響應曲面坡度非常陡峭，表示響應值對于各實驗表件改變很敏感［16］。

圖5顯示在液料比為10∶1條件下，提取溫度和乙醇體積分數對藍莓葉抑菌物質提取的影響。提取溫度對抑菌物質提取的影響顯著，曲面較陡，乙醇體積分數對抑菌物質提取的影響不太顯著，曲面相對較緩和。圖6顯示在提取溫度為60℃條件下，液料比和乙醇體積分數對藍莓葉抑菌物質提取的影響。液料比對抑菌物質提取的影響顯著，曲面較陡，乙醇體積分數對抑菌物質的影響不太顯著，曲面相對較緩和。圖7顯示在乙醇體積分數為80%條件下，液料比和提取溫度對藍莓葉抑菌物質提取的影響。液料比和提取溫度對抑菌物質提取的影響均顯著，曲面都較陡。

表4 回歸模型系數的顯著性檢驗結果Table 4 Test results of significance for regression coefficient

圖5 提取溫度和乙醇體積分數交互作用對抑菌效果影響的響應面圖Fig.5 Response surface graph indicating the effects of extraction temperature，ethanol concentration and their interactions on antibacterial activity of extract

圖6 液料比和乙醇體積分數交互作用對抑菌效果影響的響應面圖Fig.6 Response surface graph indicating the effects of material－to－liquid ratio，ethanol concentration and their interactions on antibacterial activity of extract

2.2.4 回歸方程及模型驗證 對回歸方程取一階偏導數等于零，整理得如下:

由式（1）～式（3）聯立解方程組，換算成實驗條件得到乙醇體積分數X1=85.00%，提取溫度X2= 65.83℃，液料比X3=9.18∶1。在此條件下，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑可達18.13mm。考慮實際情況將最佳工藝條件修正為乙醇體積分數85.00%，提取溫度66℃，液料比9.2∶1，重復實驗3次，實際測得的抑菌圈直徑為18.07mm，與理論預測值相比，其相對誤差約為1%，說明該模型準確可靠，具有實用價值。

圖7 液料比和提取溫度交互作用對抑菌效果影響的響應面圖Fig.7 Response surface graph indicating the effects of material－to－liquid ratio，extraction temperature and their interactions on antibacterial activity of extract

3 結論

藍莓葉抑菌物質的最佳提取工藝參數為:乙醇體積分數85.00%，提取溫度66℃，液料比9.2∶1，提取時間6h。此時，藍莓葉中抑菌物質提取效果最佳，抑菌圈直徑可達18.07mm，與模型預測值接近。本研究為藍莓葉資源的綜合利用和天然抑菌劑的開發奠定了基礎，具有重要的現實意義。

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Optim ization of extraction technology of antim icrobial substances from blueberry leaves by response surface analysis

HU Xiao1，LIChun－yang2，ZHOU Tao1，*

（1.Ginling College，Nanjing Normal University，Nanjing 210097，China; 2.Institute of Agro－food Science and Technology，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）

In order to ob tain op timum cond itions for extrac tion of antibac terial substance from b lueberry leaves，on the basis of sing le factor investigations，response surface methodology（RSM）was used to study effec ts of ethanol concentration，extrac tion tim e and solid－liquid ratio on the extraction rate of antim ic robial substances.Results showed that the op timum cond itions were as follows:ethanol concentration 85.00%，extraction temperature 66℃and liquid－to－material ratio 9.2∶1（m L/g）.Under the op tim ized cond itions，the maximum d iameter of inhibition zone was 18.07mm.

response surface m ethodology;b lueberry leaves;antibac terial;extraction p rocess

TS201.3

A

1002－0306（2012）06－0309－05

2011－06－15 *通訊聯系人

胡筱（1988－），女，碩士研究生，研究方向:食品安全。

2009年江蘇省國際科技合作項目（BZ2009025）。