美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變、熒光吸收及抗氧化性的研究

張 嚴(yán)，汪何雅，*，錢 和

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122; 2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122）

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變、熒光吸收及抗氧化性的研究

張 嚴(yán)1，汪何雅1，*，錢 和2，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122; 2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122）

采用以還原糖－氨基酸（木糖/葡萄糖分別與甘氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸）模式美拉德反應(yīng)（Maillard Reaction，MR）制備得到美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（MRPs），研究反應(yīng)條件對(duì)MRPs的褐變程度、熒光吸收強(qiáng)度以及其抗氧化活性的影響，并分析MRPs的光學(xué)特征與抗氧化活性之間的聯(lián)系。結(jié)果表明，還原糖和氨基酸的種類對(duì)MR的褐變強(qiáng)度有很大影響，其影響程度由強(qiáng)到弱分別為:Xly＞Glc，Lys＞Gly＞Glu＞Cys。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，各體系MRPs的褐變程度逐漸變強(qiáng);而熒光吸收強(qiáng)度隨著加熱時(shí)間的延長而增強(qiáng)，然后在出現(xiàn)最大值后趨于平緩或者表現(xiàn)出下降的趨勢。MRPs的抗氧化能力也隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增強(qiáng)，抗氧化活性與褐變強(qiáng)度呈正相關(guān)，與熒光吸收特性沒有表現(xiàn)出明顯的關(guān)聯(lián)。

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，褐變，熒光吸收，抗氧化活性

美拉德反應(yīng)（Maillard Reaction，MR）是羰基化合物（尤其是還原糖）與氨基化合物（氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)等）發(fā)生的一系列復(fù)雜的非酶促褐變反應(yīng)，也被稱為羰氨反應(yīng)。熱反應(yīng)和長時(shí)間的儲(chǔ)藏都會(huì)促使美拉德反應(yīng)的發(fā)生，其特殊的色澤和風(fēng)味意義使得它在食品生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用［1］。褐變是MR最顯著的特征，早期對(duì)MR的研究主要是在色度和吸光度方面，用360～490nm區(qū)間的特征吸收峰表征類黑素物質(zhì)產(chǎn)生的速率和積累程度。隨著對(duì)MR研究的深入，1942年P(guān)earce和Thistle首先發(fā)現(xiàn)MRPs具有一定的熒光吸收特性，并用以表征食品儲(chǔ)存期間的變質(zhì)［2］。目前，對(duì)于MRPs中呈現(xiàn)褐色或熒光吸收特性的具體物質(zhì)，除了少數(shù)結(jié)構(gòu)被揭示外，大量仍未知。一些研究指出MR中熒光吸收現(xiàn)象先于褐變，所以，一般認(rèn)為熒光吸收物質(zhì)是大分子褐色物質(zhì)的前體物［3］。色素物質(zhì)、熒光吸收物質(zhì)的產(chǎn)生需要一個(gè)誘導(dǎo)期，而熒光物質(zhì)所需要的誘導(dǎo)時(shí)間較短。一般將熒光物質(zhì)作為美拉德反應(yīng)的指示劑，其可以靈敏地反映美拉德反應(yīng)的早期過程［4］。大量研究發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。然而，由于MRPs的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，人們尚不完全清楚美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中具有抗氧化活性的是何物質(zhì)。一些針對(duì)不同食品體系中MRPs的抗氧化活性與其光學(xué)特征之間的相關(guān)性研究，也一直存在著爭議。一些實(shí)驗(yàn)表明，葡萄糖與賴氨酸、甘氨酸的模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性與顏色呈現(xiàn)一定的線性相關(guān)性（與褐變顏色成正比），并指出這是因?yàn)榉磻?yīng)產(chǎn)生類黑精的緣故［5－9］。但也有學(xué)者在對(duì)MRPs清除DPPH自由基的研究中發(fā)現(xiàn)，褐變與清除效果沒有關(guān)系，但熒光吸收特性與清除活性有關(guān)，認(rèn)為熒光吸收可以表征清除自由基能力［10］。本工作沿用還原糖－氨基酸的模式美拉德反應(yīng)，測定不同美拉德反應(yīng)條件（還原糖和氨基酸種類，反應(yīng)時(shí)間）對(duì)產(chǎn)物褐變程度、熒光吸收強(qiáng)度以及抗氧化活性的影響，并分析其褐變、熒光吸收與抗氧化活性之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘氨酸（Gly）、葡萄糖（D－Glc）、鹽酸、三氯乙酸、維生素C（VC）、石油醚、二甲基硅油 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;L－賴氨酸（L－Lys）、半胱氨酸（Cys）、谷氨酰胺（Glu）、木糖（D－Xyl） 生化試劑，純度大于98%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH） sigma公司。

PB303－N電子天平、Delta 320pH計(jì) Mettler－Toledo Group公司;HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇榮華儀器制造有限公司;TU－1900雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;R－501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司; KH－500B超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀表制造有限公司;Centrifuge 5804r/min臺(tái)式高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司;F－7000日立熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備 用磷酸緩沖液（pH 7.0）將各氨基酸（甘氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺）與還原糖（葡萄糖，木糖）按物質(zhì)的量比1∶1配成反應(yīng)混合液（0.4mol/L:0.4mol/L），用 6mol/L NaOH與6mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為7.0，制備得Glc－Gly、Glc－Lys、Glc－Glu、Glc－Cys;Xyl－Gly、Xyl－Lys、Xyl－Glu、Xyl－Cys共8種模式美拉德反應(yīng)體系。將各體系置于100℃油浴中加熱回流處理，在不同的時(shí)間（0、15、30、60、90、120、180、240m in）分別進(jìn)行取樣測定。

1.2.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度的測定 將MRPs用蒸餾水稀釋50倍，采用可見分光光度計(jì)在420nm處測定吸光度［10－11］。

1.2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物熒光吸收強(qiáng)度的測定 用m ili－Q水稀釋MRPs（1/50，v/v），以防止熒光的猝滅效應(yīng)。稀釋的溶液在激發(fā)波長（λEx）347nm，發(fā)射波長（λEm）415nm下測定熒光吸收強(qiáng)度［12－13］。

1.2.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的測定

1.2.4.1 大豆卵磷脂脂質(zhì)體的制備［14］將一定量的大豆卵磷脂溶解于石油醚（30～60℃）中，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（35 r/m in，40℃）去除有機(jī)溶劑，得到分散的卵磷脂薄膜，取下后立即用氮?dú)獯蹈伞Ｏ蚵蚜字∧ぶ屑尤?0mmol/L，pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液，超聲處理得到白色乳狀的脂質(zhì)體溶液（LPS）。

TCA－TBA－HCl溶液的配制:將15g三氯乙酸（TCA）、3.7g硫代巴比妥（TBA）、2.1m L鹽酸（HCl）依次加入100m L水中，充分混合。

1.2.4.2 MRPs對(duì)AAPH誘導(dǎo)卵磷脂脂質(zhì)體氧化水平的影響 在實(shí)驗(yàn)之前首先確定AAPH誘導(dǎo)氧化的最佳反應(yīng)條件（LPS濃度、AAPH濃度、反應(yīng)時(shí)間），然后再在該最佳條件下測定樣品對(duì)AAPH誘導(dǎo)卵磷脂脂質(zhì)體氧化水平的影響。

AAPH誘導(dǎo)氧化的最佳反應(yīng)條件的確定:在試管中依次加入1m L一定濃度的LPS，2m L一定濃度的AAPH溶液，搖勻，37℃水浴避光放置不同時(shí)間，取出冷卻后加入TCA－TBA－HCl溶液2m L，混勻后沸水加熱15m in，迅速冷卻，5500 r/m in離心20m in，取上清液于532nm測定得到吸光度A［15］。通過硫代巴比妥反應(yīng)物質(zhì)（TBARS）在532nm的摩爾吸收系數(shù)1.56×105L·mol－1·cm－1，由比爾定律 A= εbc計(jì)算TBARS含量。通過LPS濃度、AAPH濃度以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)TBARS影響的曲線，確定最佳反應(yīng)條件。

在確定的最佳反應(yīng)條件下，在試管中依次加入1m L的LPS、2m L的AAPH和1m L樣品，搖勻，37℃水浴避光放置確定好的時(shí)間，取出冷卻后加入TCATBA－HCl溶液2m L，混勻后沸水加熱15m in，迅速冷卻，5500 r/m in離心20m in，取上清液置于532nm處測得吸光度As。對(duì)照組以蒸餾水代替樣品，測得吸光度Ac。另外，由于樣品的顏色對(duì)TBARS吸光度的測定有較大的影響，所以還要扣除樣品自身在532nm處的吸光度。在實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，用蒸餾水代替除樣品外所加入的其他試劑，并作同樣的處理，在532nm處測得吸光度值為A樣品。樣品對(duì)脂質(zhì)體氧化的抑制率的計(jì)算公式為:

1.2.4.3 MRPs對(duì)Fe3+/VC誘導(dǎo)卵磷脂脂質(zhì)體氧化水平的影響 在試管中依次加入1m L 10mg/m L LPS，1m L 400μmol/L的FeCl3、1m L 400μmol/L的VC以及1m L的樣品，振蕩搖勻［16］。37℃水浴避光放置1h，其余操作及對(duì)照組等其他的實(shí)驗(yàn)及抑制率的計(jì)算方法同1.2.4.2。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同體系MRPs的褐變程度

MRPs經(jīng)稀釋后在420nm處測得的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的變化規(guī)律見圖1。由圖1可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，MRPs的褐變程度逐漸增強(qiáng)。并且，在反應(yīng)前30m in，木糖－賴氨酸反應(yīng)產(chǎn)生褐變物質(zhì)的速率最快，30m in后逐漸趨于平緩。葡萄糖－賴氨酸在反應(yīng)初期的褐變程度低于木糖－賴氨酸，但后期（60m in后）褐變程度在所有體系中最強(qiáng)。賴氨酸是四種氨基酸中發(fā)生美拉德反應(yīng)最強(qiáng)烈的一種，這可能是由于賴氨酸含有兩個(gè)氨基，它與還原糖具有更快的MR反應(yīng)速度。從圖1中還可以看出，葡萄糖－半胱氨酸反應(yīng)產(chǎn)生褐變程度最弱，幾乎不產(chǎn)生褐色素。

總體來說，木糖比葡萄糖更容易發(fā)生MR，產(chǎn)生褐色素;氨基酸種類對(duì)美拉德反應(yīng)具有很大影響，其對(duì)褐變程度的影響由強(qiáng)到弱為賴氨酸＞甘氨酸＞谷氨酸＞半胱氨酸。

圖1 MRPs的褐變程度隨反應(yīng)時(shí)間的變化規(guī)律Fig.1 The browning trends of MRPs derived with different heating time

2.2 不同體系MRPs的熒光吸收強(qiáng)度

圖2顯示了不同體系中MRPs的熒光吸收強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間變化的規(guī)律。由圖2可以看出，與各體系的褐變物質(zhì)產(chǎn)生規(guī)律不同，大多體系（除葡萄糖/木糖－半胱氨酸體系和葡萄糖－谷氨酸外）中熒光吸收物質(zhì)在很短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大值，然后隨著反應(yīng)的延長而降低。這說明在MR過程中，熒光吸收物質(zhì)在反應(yīng)的前期形成，隨著反應(yīng)進(jìn)程的推進(jìn)，它們進(jìn)一步參與反應(yīng)，形成大分子的MRPs，并部分失去具有熒光吸收的結(jié)構(gòu)。

圖2 MRPs的熒光吸收強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的變化規(guī)律Fig.2 The fluorescence intensity of MRPs derived with different heating time

2.3 MRPs抗氧化性的測定結(jié)果

2.3.1 AAPH誘導(dǎo)脂質(zhì)體氧化的最佳反應(yīng)條件的確定 通過單因素實(shí)驗(yàn)，得出LPS濃度、AAPH濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)AAPH誘導(dǎo)的脂質(zhì)體氧化程度的影響，分別見圖3～圖5。由圖3～圖5可見，AAPH誘導(dǎo)脂質(zhì)體氧化的最佳反應(yīng)條件為10mg/m L LPS、8mmol/L的AAPH溶液、反應(yīng)60m in。

2.3.2 MRPs對(duì)AAPH誘導(dǎo)和Fe3+/VC誘導(dǎo)脂質(zhì)體氧化水平的影響 在2.3.1的條件下，測定的各體系MRPs對(duì)AAPH和Fe3+/VC誘導(dǎo)脂質(zhì)體氧化水平的影響見圖6。由圖6可以看出，絕大部分還原糖－氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生的MRPs都具有一定的抗氧化活性，并且隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間的延長，MRPs的抗氧化能力增強(qiáng)。其中還原糖－賴氨酸反應(yīng)產(chǎn)物對(duì) AAPH和Fe3+/VC誘導(dǎo)脂質(zhì)體氧化都具有最強(qiáng)的抑制活性;而還原糖－半胱氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性最弱，甚至在反應(yīng)的開始階段它們還表現(xiàn)出很強(qiáng)的促氧化性。在葡萄糖－氨基酸和木糖－氨基酸反應(yīng)體系中，不同氨基酸產(chǎn)生的MRPs的抗氧化活性由強(qiáng)到弱均為Lys＞Gly＞Glu＞Cys;在葡萄糖、木糖與同種氨基酸反應(yīng)體系中，兩種還原糖產(chǎn)生的MRPs的抗氧化活性由強(qiáng)到弱為X ly＞Glc。MRPs的抗氧化活性與其褐變程度相同。

因此，從以上結(jié)果可以推測，模式美拉德反應(yīng)體系中，MRPs的抗氧化活性主要來源于那些具有褐色的類黑精，但其他一些非色素成分也可能會(huì)發(fā)揮一部分作用。

圖3 LPS濃度對(duì)TBARS含量的影響Fig.3 The influence of LPS concentration on TBARS （反應(yīng)1h，AAPH的濃度為5mmol/L）

圖4 AAPH濃度對(duì)TBARS含量的影響Fig.4 The influence of AAPH concentration on TBARS （LPS濃度為10mg/mL，反應(yīng)1h）

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)TBARS含量的影響Fig.5 The influence of reaction time on TBARS （LPS濃度為10mg/mL，AAPH的濃度為8mmol/L）

圖6 MRPs對(duì)卵磷脂脂質(zhì)體的抗氧化活性Fig.6 The antioxidantion activity of MRPs in LPS

3 結(jié)論

隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，各美拉德反應(yīng)體系的褐變程度逐漸變強(qiáng);考察了不同還原糖、氨基酸對(duì)其反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度的影響，發(fā)現(xiàn)其規(guī)律為:Xly＞Glc，Lys＞Gly＞Glu＞Cys。MR過程中，熒光吸收物質(zhì)更傾向于在反應(yīng)早期階段產(chǎn)生，MRPs的熒光吸收強(qiáng)度在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大值，隨后緩慢降低。

絕大部分還原糖－氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生的MRPs都具有一定的抗氧化活性，并且隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間的延長，MRPs的抗氧化能力增強(qiáng)，這與其褐變的變化規(guī)律一致。其中還原糖－賴氨酸反應(yīng)產(chǎn)物具有最強(qiáng)的抑制活性。在葡萄糖/木糖－氨基酸反應(yīng)體系中，不同氨基酸產(chǎn)生的 MRPs的抗氧化活性由強(qiáng)到弱均為 Lys＞Gly＞Glu＞Cys。因此，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性與其褐變程度具有較強(qiáng)的相關(guān)性。

［1］王延平，馬志玲.美拉德反應(yīng)的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，1999（1）:15－19.

［2］Pearce J A，Thistle M A.Fluorescence as a measurement of quality in dried whole egg powder［J］.Journal of Cancer Research，1942，20:276－282.

［3］孫麗平.美拉德反應(yīng)體系的光譜學(xué)特性、抗氧化活性及評(píng)價(jià)方法［D］.青島:中國海洋大學(xué)，2009.

［4］Wendy M Baisier，Theodore P Labuza.Maillard browing kinetics in a liquid model system［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，1992，40:701－713.

［5］Wagner K H，Derkits S，Herr M，et al.Antioxidant potential of melanoidins isolated from a roasted glucose－glycine model［J］. Food Chemistry，2002，78:375－382.

［6］H Lingnert，C Eriksson.Progress in food nutrition and science［M］.Oxford:Pergammon Press，1982:453－466.

［7］張凌燕，李倩，尹姿，等.3種氨基酸和葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的物理化學(xué)特性及抗氧化活性研究［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2008，8（3）:12－22.

［8］M Anese，L Manzocco，M C Nicoli，et al.Antioxidant properties of tomato juice as affected by heating［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1999，79:750－754.

［9］Yamaguchi T，Iki M.Antioxidantion Activity of Maillard recation Produts［J］.Agriculture and Biology Chemistry，1986，50: 2983－2985.

［10］馬志玲，王延平，吳京洪.模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性能的研究［J］.中國油脂，2002，27（4）:68－71.

［11］Morales F J.Free radical scavenging capacity of Maillard reaction products as related to colour and fluorescence［J］.Food Chemistry，2001，72:119－125.

［12］Jing H，Kitts D D.Comparison of the antioxidative and cytotoxic properties of glucose－lysine and fructose－lysine Maillard reaction products［J］.Food Research International，2000，33:509－516.

［13］Morales F J，Romero C，Jimenez PS.Fluorescence associated with Maillard reaction inmilk and milk resembling systems［J］. Food Chemistry，1996，57:423－428.

［14］Alejandra N C，Lidia L P，Graciela B，et al.Antioxidant effects ofwater－and lipid－soluble nitroxide radicals in liposomes［J］.Free Radical Biology and Medicine，2004，37（12）:2042－2051.

［15］Yilmaz Y，Toledo R.Antioxidant activity of water－soluble Maillard reaction products［J］.Food Chemistry，2005，93（2）:273－278.

［16］項(xiàng)惠丹.抗氧化微膠囊壁材的制備及其在微膠囊化魚油中的應(yīng)用［D］.無錫:江南大學(xué)，2008.

Research of the browning，fluorescence characteristics and antioxidant activity of the Maillard reaction products

ZHANG Yan1，WANG He－ya1，*，QIAN He2，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China; 2.State Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The Maillard reaction p roducts（MRPs）were p repared by using xylose（pentose），g lucose（hexose）and d ifferent am ino acids（g lycine，lyscine，g lutam ine，cysteine）by model Maillard reac tion.The influence of reaction conditions on browning，fluorescence charac teristics and antioxidant ac tivity was surveyed.Then the connec tion of the three aspects were analyzed.The results indicated that the sugars and am ino acids had different reaction power:Xly＞G lc，Lys＞G ly＞Glu＞Cys.The browning of every systems increased and the fluorescence intensity had a maximum value and then becam e sm ooth or dec reased.The antioxidant capacity was p roportional to b rowning，but d id not show significant association w ith the fluorescence intensity changes.

Maillard reac tion p roduc ts（MRPs）;b rowning;fluorescence;antioxidant ac tivity

TS201.2

A

1002－0306（2012）06－0193－04

2011－06－09 *通訊聯(lián)系人

張嚴(yán)（1985－），男，碩士研究生，研究方向:食品加工與安全質(zhì)量控制。