GPC-HPLC-FLD法測定動植物油脂中的苯并(a)芘

馬君剛，張煌濤，于 紅，任水英*

(國家農副產品監督檢驗中心(新疆)，新疆 烏魯木齊 830004)

GPC-HPLC-FLD法測定動植物油脂中的苯并(a)芘

馬君剛，張煌濤，于 紅，任水英*

(國家農副產品監督檢驗中心(新疆)，新疆 烏魯木齊 830004)

建立動植物油脂中苯并(a)芘殘留量的凝膠凈化-高效液相色譜-熒光檢測的測定方法。方法采用凝膠色譜凈化系統處理樣品，可除去油脂中甘油三酯等雜質的干擾。色譜條件：Hypersil ODS2(150mm×4.6mm，5μm)反相色譜柱，流動相為甲醇-水(94∶6，V/V)，流速1.0mL/min，激發波長365nm，發射波長406nm，柱溫30℃。方法的檢出限0.1μg/kg，線性范圍0.1～50μg/kg，加標回收率92.0%～106.0%，相對標準偏差為1.86%(n＝6)。該法具有樣品預處理簡單、靈敏度高、精密度高等優點，可用于動植物油脂樣品中苯并(a)芘的快速準確測定。

苯并(a)芘；GPC凈化系統；高效液相色譜；熒光檢測；動植物油脂

苯并(a)芘，即3,4-苯并芘，是一種高活性致癌劑。苯并(a)芘可通過呼吸、食道、皮膚吸收等途徑進入人體，主要可誘發皮膚、肺、消化道和膀胱癌[1]，同時可損害中樞神經、破壞淋巴細胞、影響肝臟功能和DNA修復能力等，具有致畸、致突變作用。苯并(a)芘對人體的內分泌系統也有一定的干擾作用，對人類的生存和繁衍構成嚴重的威脅[2]。

苯并(a)芘廣泛存在于自然環境中，食品中也不例外，如煙熏食品、燒烤肉食品、油炸食品、動植物油脂等，被認為是由煤炭、石油、天然氣、木材等不完全燃燒產生的[3]。文獻中關于水質[4]、空氣[5-7]、油炸食品[8]以及肉制品[9-10]中的苯并(a)芘檢測方法報道很多，動植物油脂中苯并(a)芘的檢測也一直處于探索階段?，F行標準GB/T 5009.27—2003《食品中苯并(a)芘的測定》[11]、GB/T 22509—2008《動植物油脂苯并(a)芘的測定：反相高效液相色譜法》[12]前處理步驟繁多，耗時費力，條件苛刻；陶順興等[13]、蔡玉枝等[14]采用甲酸除去樣品中的色素等雜質，再用甲酸咖啡因萃取經凈化的樣品中的苯并(a)芘，同樣存在著前處理復雜等問題。吳海智等[15]采用直接將油脂稀釋定容的方法進行前處理，雖然簡便，但干擾雜質多，檢出限高，對色譜柱污染也很嚴重。本方法采用GPC凝膠凈化系統除去干擾物質，建立凝膠滲透色譜-高效液相色譜-熒光檢測(gel permeation chromatography-high performance liquid chromatograghy-fluorescence detector，GPC-HPLC-FLD)簡便、準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

動植物油脂 市售。

苯并(a)芘標準品(含量99.5%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司；環己烷、乙酸乙酯和四氫呋喃(均為分析純) 天津永大化學試劑有限公司；乙腈、甲醇(均為色譜純)美國Fisher公司；水為艾科浦超純水機制備的超純水。

1.2 儀器與設備

GPC凈化系統配紫外檢測器、AccuPrep MPSTM GPC快速凈化柱 美國J2 Scientific公司；1100型液相色譜儀(配熒光檢測器) 美國安捷倫公司；R系列旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司；N-EVAPTM 116氮吹儀美國Organomation公司；艾科浦超純水機 重慶頤洋企業發展有限公司。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取苯并(a)芘標準品適量，用甲醇溶解，配制成質量濃度為100μg/kg的標準儲備液。再分別準確量取標準儲備液適量，稀釋成0.1、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0ng/mL系列標準使用液。

1.4 樣品處理

稱取約1.0g(精確到0.1mg)樣品，用環己烷-乙酸乙酯(1∶1)溶解并定容于10.0mL，將稀釋液轉移至GPC配備的樣品瓶中，上樣于GPC凈化系統。以環己烷-乙酸乙酯(1∶1)為流動相，流速4.7mL/min凈化，收集16～22min的洗脫液，將所得的洗脫液在氮吹儀上(40℃)吹干或旋轉蒸發儀上減壓蒸干，用乙腈-四氫呋喃(90∶10)溶液溶解并定容于0.5mL，用0.45μm有機濾膜過濾后待測。

1.5 高效液相色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2(150mm×4.6mm，5μm)，流動相：甲醇-水(94∶6，V/V)，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃；激發波長：365nm；發射波長：406nm，進樣量10μL。

1.6 苯并(a)芘的定性定量方法

采用標準物質的保留時間對樣品峰進行準確定性，采用外標法以峰面積計算定量，將不同質量濃度的苯并(a)芘標準溶液進樣分析，以質量濃度/(μg/L)為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.7 加標回收率及精密度實驗

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將苯并(a)芘標準溶液加入空白樣品中，配制成苯并(a)芘質量加標量為5.0μg/kg的測試樣品，用兩種國標方法和本論文所建立的方法分別測定苯并(a)芘含量，測試6次，計算回收率和相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。并對6種動植物油脂樣品及苯并(a)芘加標量為10.0、20.0μg/kg的樣品進行分析測試，計算檢出限、精密度、回收率。

2 結果與分析

2.1 GPC凈化系統的使用

本實驗采用GPC凈化系統處理樣品。為確定苯并(a)芘的洗脫時間，取大濃度的苯并(a)芘溶液上樣，在波長254nm處檢測，GPC凈化系統條件設置同1.4節，得到譜圖如圖1所示。樣品中的苯并(a)芘在16～22min內被洗脫完全，故樣品處理可依此時間段收集洗脫液。用樣品進行實驗，得到譜圖如圖2所示，可知甘油三酯等較大分子均在16min前得到完全洗脫，16～22min收集的洗脫液中不含或含較少量甘油三酯等較大分子。該方法實現了樣品前處理的自動化，減少了前處理步驟，最大限度的降低了待測組分的損失。同時，可去除雜質干擾物，避免了油脂分子進入液相色譜柱干擾測試，保護了色譜柱，延長其使用壽命，并提高的儀器的靈敏度。

圖1 苯并(a)芘標準物質的GPC色譜圖Fig.1 Gel permeation chromatogram of standard benzo (a) pyrene

圖2 樣品的GPC色譜圖Fig.2 Gel permeation chromatogram of sample

2.2 色譜條件的優化

色譜條件對檢測起著至關重要的作用，因此對色譜條件進行優化。比較幾種流動相配比條件下的色譜峰，最后發現當甲醇∶水＝94∶6時，保留時間、容量因子適當，基線噪聲最低，同時苯并(a)芘和樣品中干擾物能達到較好的基線分離。對苯并(a)芘標準溶液分別用激發波長365、375、384nm，發射波長406、410、415nm進行測定，發現激發波長384nm、發射波長406nm時，苯并(a)芘標準溶液的響應值最大。標準溶液及陽性樣品的液相色譜圖如圖3所示。

圖3 苯并(a)芘標準溶液(A)及陽性樣品(B)的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of benzo (a) pyrene standard and positive sample

2.3 高效液相色譜柱的選擇

本實驗考察數家不同廠家、不同牌號的色譜柱，包括Hypersil ODS2、ZORBAX Eclipse XDB C18、symmetry C18、LiChrosob RP-18、LUNA C18、Inertsil ODS-3、ZORBAX Eclipse PAH。發現每種色譜柱均能滿足用本方法處理后的樣品測試，并不需要諸如ZORBAX Eclipse PAH等多環芳烴專用分析柱。因此本實驗選用價格相對低廉的Hypersil ODS2色譜柱。

將不同濃度的加標樣品進行處理并測試，以質量濃度/(μg/L)為橫坐標(X)、峰面積為縱坐標(Y)，測定結果經線性回歸，線性方程為Y＝1.83×107X＋1025，線性范圍為0.1～50ng/mL；線性相關系數為0.9991。以3倍噪聲值與最小濃度的色譜峰峰高比較，計算出檢出限為0.1ng/mL，按測定方法計算，本方法最低檢出限為0.1μg/kg，線性范圍0.1～50μg/kg。對抽取的樣品進行處理分析，并做了不同濃度的加標實驗，表1為6種樣品以及10、20μg/kg加標量的分析結果，從表1可以看出，樣品的加標回收率處于92.0%～106.0%之間。

表1 6種樣品的測試結果及加標回收率Table 1 Results of six samples and recovery

3 討 論

3.1 本方法與國家標準方法的對比

現行國家標準中可用于動植物油脂中苯并(a)芘檢測的方法有GB/T 5009.27—2003、GB/T 22509—2008。本實驗與這兩種國標方法相比均根據苯并(a)芘的熒光特性，采用成熟的熒光分光光度計或高效液色譜儀-熒光檢測器進行檢測，但在樣品前處理過程中三者區別很大。眾所周知，現代儀器分析中耗費時間和精力最多、對結果準確性影響最大的因素即為樣品前處理?，F對3種方法的前處理過程對比如下：

GB/T 5009.27—2003采用熒光分光光度計測試，由于未通過色譜柱將苯并(a)芘與油脂中甘油三酯等干擾物分離，必須通過液-液萃取、氧化鋁層析柱凈化、紙色譜分離等復雜的前處理步驟將苯并(a)芘從油脂中提取出來。該操作過程繁雜，實驗周期長，勞動強度大，同時由于無法保證不同批次間氧化鋁和紙色譜用濾紙條的活度、特性一致，此方法的最小檢出量高，精密度較差、回收率也較低。

GB/T 22509—2008采用Brockmann活度Ⅳ級的中性氧化鋁層析柱對樣品進行凈化處理。利用中性氧化鋁中鋁原子與苯并(a)芘等芳香烴類富電子化合物的作用力，使之保留在層析柱上。然而中性氧化鋁作為正相色譜中具有強極性保留的填料，同樣對動植物油脂中主要組份甘油三酯等分子結構上具有極性酯基的油脂分子有保留作用。由于樣品甘油三酯含量遠遠大于苯并(a)芘含量，兩者含量之差可達十億倍以上，這就很難保證在不損失或少損失苯并(a)芘的前提下，過柱后的樣品處理液中油脂分子能夠減少到不影響極微量苯并(a)芘測定的含量水平。雖然可以通過調節中性氧化鋁中含水量來嚴格控制其Brockmann活度，達到保證油脂分子與苯并(a)芘的最大分離度，但這種平衡關系對氧化鋁中含水量的微小變化非常敏感。樣品、洗脫液中微量的水分不可避免的被極易吸水的氧化鋁吸附后必將破壞最初建立的實驗條件與效果。同樣會導致檢出限、精密度、回收率無法得出滿意的結果。

本方法通過GPC凈化系統處理樣品，可去除樣品中的油脂分子、色素等雜質的干擾。GPC凈化系統原理為體積排阻色譜，可根據樣品分子中各組分分子質量的不同將其分離，分子質量大的組分先流出，分子質量越小的組分越容易被凝膠顆粒中的孔洞所阻滯，流出越慢。油脂的皂化值一般在180～200mg/g之間，由此可算出其主要成分甘油三酯的平均相對分子質量在800～1000之間。油脂中甘油三酯平均相對分子質量與相對分子質量僅為252的苯并(a)芘相比，差異很大，這使得兩者在GPC凈化系統中能夠得到很好的分離，達到去油效果。同時體積排阻色譜的分離機理只與分子質量相關，樣品組分和固定相之間保留機理簡單，兩者之間原則上不存在相互作用力，使得凝膠凈化柱清洗過程簡單，使用壽命長，即使大量、多次上樣也很容易恢復到初始柱效。而采用商品化成品柱，性能穩定，質量有充分保證。基于以上優點，本方法實驗過程中不需過多考慮凈化柱的次級保留效應，以及樣品中強保留的雜質分子滯留在柱上引起凈化柱保留特性的改變等因素，使得整個凈化過程發始終在可控條件下運行，避免了國標方法需時刻關注不同批次試劑質量，二氧化鋁活性變化，樣品污染凈化柱，待測組分與雜質分離不完全等因素引起的工作量加大，苯并(a)芘損失，精密度下降，方法無法重現的現象。

將一空白樣品加標配制成苯并(a)芘為5.0μg/kg的測試樣，用3種方法分別測試6次，檢出限、精密度、回收率見表2。表明本實驗建立的方法在這些參數方面均優于兩種國家標準，測試結果更為準確可靠。3.2 注意事項

表2 苯并(a)芘3種檢測方法的參數比較Table 2 Parameter comparison of three detective methods of benzo (a) pyrene

該檢測方法使用熒光檢測器，熒光檢測器靈敏度高，對于極微量的苯并(a)芘既有較高的響應值。然而，苯并(a)芘廣泛存在于自然界中，特別是有機試劑在生產、運輸、儲存過程中極易產生苯并(a)芘，因此對于靈敏度極高的本方法，很容易產生假陽性。所以本方法對試劑提出了嚴格的要求，GPC凈化系統的洗脫液最好使用高純的環己烷和乙酸乙酯；若使用分析純試劑，必須進行空白實驗，并在結果計算時給予扣除。另外，液相色譜流動相中溶解的少量氧氣易產生熒光猝滅效應，即使帶有在線脫氣機的儀器，流動相在使用前也要脫氣處理。

4 結 論

本實驗建立了動植物油脂中苯并(a)芘殘留量的測定方法，該方法樣品前處理簡單，去除雜質效果好，靈敏度高，精密度、方法復現好等優點，是測定動植物油脂中苯并(a)芘含量的理想方法。

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Determination of Benzo(a) pyrene in Animal Fats and Vegetable Oils by Gel Permeation- High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector

MA Jun-gang，ZHANG Huang-tao，YU Hong，REN Shui-ying*
(National Quality Supervision Test Center of Agricultural Byproducts (Xinjiang), U..ru..mqi 830004, China)

This paper describes a method to determine benzo(a) pyrene in animal fats and vegetable and oils using gel permeationhigh performance liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FLD). In this method, gel permeation cleanup system was used to remove the interference such as triglyceride. Chromatographic separation was achieved by a reverse-phase column of Hypersil ODS2 with the mobile phase consisting of methanol-water (94∶6,V/V) at a flow rate of 1.0 mL/min. FLD were set at 365 nm excitation and 406 nm emission wavelengths, and the column temperature was kept at 30 ℃. The limit of detection was 0.1μg/kg, the calibration curve was linear between a concentration range of 0.1－50μg/kg, the recoveries were in the range of 92.0%－106.0%, and RSD (n＝ 6) value was 1.86%. The method is simple, rapid, accurate and sensitive for directly determining benzo(a)pyrene in animal fats and vegetable oils without complicated and time-consuming separation process.

benzo(a)pyrene；GPC cleanup system；high performance liquid chromatography (HPLC)；fluorescence detection (FLD)；animal fats and vegetable oils

TS207.3

A

1002-6630(2012)10-0278-04

2011-04-30

馬君剛(1974—)，男，高級工程師，碩士，主要從事食品檢驗研究。E-mail：mjg205270@sina.com

*通信作者：任水英(1981—)，女，工程師，碩士，主要從事食品檢驗研究。E-mail：renshuiying@yahoo.com