不同植物源蜂膠揮發性成分差異分析

延 莎，張紅城，董 捷*

(中國農業科學院蜜蜂研究所，農業部國家蜂產品加工專業分中心，北京 100093)

不同植物源蜂膠揮發性成分差異分析

延 莎，張紅城，董 捷*

(中國農業科學院蜜蜂研究所，農業部國家蜂產品加工專業分中心，北京 100093)

采用頂空固相微萃取-氣質聯用技術分析4種不同植物來源的蜂膠揮發性成分，并結合主成分分析法對其進行分析。結果表明，不同植物源的蜂膠揮發性成分存在差異，主要表現在共有組分的含量和特有組分兩個方面。其中的共有組分有3-甲基-3-丁烯-1-醇、異戊二烯、4-戊烯-1-乙酸酯、梨醇酯、4-異丙基甲苯、檸檬烯、桉葉油醇、3-蒈烯、壬醛、α-古巴烯、α-依蘭油烯、去氫白菖烯、β-馬欖烯、β-桉葉醇和α-桉葉醇，它們在各樣品中的含量相差較大。特有組分，如：樣品a，α-松油烯、α-柏木烯；樣品c，α-姜黃烯、α-愈創木烯；樣品d，石竹烯、γ-依蘭油烯、苯甲酸芐酯。實驗結果有利于提取蜂膠的特征信息，進行指紋圖譜及區分模型的研究。

蜂膠；膠源植物；揮發性成分；固相微萃取；主成分分析

蜂膠是蜜蜂將采自植物的枝條、葉芽及愈傷組織等的分泌物與上腭腺、臘腺等的分泌物同少量花粉混合后所形成的黏性物質[1]。大量研究已經證明，蜂膠具有多種藥理作用，抑菌、抗真菌、抗病毒、抗炎癥、保肝、抗氧化和抗腫瘤等[2]。有報道指出，蜂膠的化學組成及功能特性與當地的植物源息息相關[3-4]。蜂膠中的化學成分由揮發性成分和非揮發性成分共同組成，其中的一些揮發性成分形成了蜂膠獨特的氣味，可作為一個重要的質量指標，具有指紋特征[5]。以往，研究者習慣于比較不同產地蜂膠的揮發性成分，如，Melliou等[6]研究了希臘5個不同地區的蜂膠揮發性成分，結果表明所有樣品揮發性成分的組成主要是萜類化合物，尤其是α-蒎烯。在國內，也有一些研究者對不同產地的蜂膠揮發性成分進行了研究，曾晞等[7]用氣相色譜-質譜法分析比較了貴州兩個產地的蜂膠揮發油化學成分，結果表明兩地蜂膠所含揮發油種數相近，成分有一定差異但不大。但是，來源產地的差異無法反映出不同蜂膠樣品本質上的差異，因為膠源植物才是決定蜂膠差異的更為重要的因素。本實驗利用頂空固相微萃取和氣質聯用技術(headspace-solid phase microextraction-gas chroma-tography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)分析4 種不同植物來源的蜂膠樣品，并結合主成分分析法對其揮發性成分進行比較，以期為蜂膠質量評價及其標準制定提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛膠樣品由國家蜂產業技術體系的專家通過當地的蜂業推廣站直接提供，膠源信息見表1。

表1 蜂膠樣品的產地及主要膠源植物Table 1 Original regions and plant sources of propolis samples

1.2 儀器與設備

PL303電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；7890A GC/5975C MS氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent 公司；中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；手動固相微萃取裝置、DVB/Carboxen/PDMS萃取纖維(2cm-50/30μm) 美國Supelco公司；FDB02DD型加熱器 英國Techne公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠原料前處理

毛膠剔除雜質后放入冷凍柜冷凍4h以上，取出后迅速放入中草藥粉碎機粉碎，過20目篩備用。

1.3.2 蜂膠揮發性成分的提取

對萃取時間、萃取溫度和萃取頭3個固相微萃取條件進行優化。結果表明，使用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維，55℃萃取45min為最適宜萃取條件。

準確稱取0.5g蜂膠樣品，置于15mL頂空瓶中，55℃平衡15min，然后將裝有萃取頭的手動進樣器插入頂空瓶中(萃取頭使用前根據說明書進行老化)，55℃頂空吸附45min，260℃解吸5min。

1.3.3 氣相色譜-質譜條件

氣相色譜條件：HP-5MS毛細管色譜柱(30m×250μm，0.25μm)；初始溫度40℃，保持3min，5℃/min升溫到200℃，保持1min，再以12℃/min升至260℃，保持1min。進樣口溫度：260℃；載氣He，流速1.0mL/min；5∶1 分流進樣。

質譜條件：電離方式EI；電子能量70eV；離子源溫度230℃；接口溫度280℃；掃描質量范圍45～550u。各組分經過NIST標準譜庫檢索和Wiley譜庫相匹配。

1.3.4 數據處理方法

每個樣品重復3次，根據面積歸一法得到每種揮發性成分的相對含量。利用Alpha MOS公司的電子鼻自帶數據處理軟件，版本12.3，以在不同保留時間流出的化合物作為不同指標，對4個樣品各組分的相對含量，12組數據進行主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2 結果與分析

2.1 HS-SPME-GC-MS檢測結果

圖1 HS-SPME-GC-MS法測定樣品c揮發性成分的GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion current of volatile components in propolis determined by HS-SPME-GC-MS

通過HS-SPME-GC-MS法得到的蜂膠揮發性成分的總離子流圖(樣品c)見圖1，各樣品主要的揮發性成分及根據面積歸一法得到的相對含量見表2。膠源植物主要為黨參的蜂膠樣品根據保留時間共得到66個組分，占總組分的97.5073%，其中3-甲基-2-丁烯醛(5.133%)、苯甲醛(5.1179%)、α-柏木烯(9.5903%)、β-馬欖烯(6.7502%)、β-桉葉醇(7.2866%)和α-桉葉醇(6.025%)含量較高；主要膠源植物為楊樹的蜂膠樣品共得到68個組分，占到總組分的96.9488%，其中苯甲醇(13.4731%)、壬醛(4.6823%)、苯甲酸(10.7157%)、α-紫穗槐烯(5.1566%)、β-桉葉醇(5.0611%)和α-桉葉醇(5.6298%)相對含量較高；主要膠源植物為毛栗子、五蓓子和漆樹的蜂膠樣品共得到74個組分，占總組分的97.1627%，其中苯乙烯(3.5063%)、苯甲醛(17.7887%)、桉葉油醇(3.7663%)、苯甲醇(19.4435)和壬醛(6.0427%)相對含量較高；主要膠源植物為椴樹、松樹和楊樹的蜂膠樣品得68個揮發性組分，占總組分的98.613%，其中苯甲醛(11.2215%)、苯甲醇(27.8108%)的含量顯著高于此樣品中的其他組分。

表2 不同植物源蜂膠各揮發性成分組成及其相對含量Table 2 Chemical compositions and relative contents of volatile components in propolis samples from different plant sources

續表2

2.2 主成分分析結果

表3 主成分的累積方差貢獻率Table 3 Cumulative proportion of principal components

圖2 不同植物源蜂膠主成分分析結果Fig.2 PCA results of propolis samples from different plant sources

如表2所示，通過HS-SPME-GC-MS所檢測到的蜂膠揮發性組分很多，很難從中明顯地發現不同植物源蜂膠樣品之間的差異程度。主成分分析的中心目的是將數據降維，以排除眾多化學信息共存中相互重疊的信息。它是將原變量進行轉換，使少數幾個新變量成為原變量的線性組合，同時，這些變量要盡可能多地表征原變量的數據結構特征而不丟失信息。新變量互不相關，即正交[8-9]。如表2所示，第1主成分的方差貢獻率為69.737%，第2主成分的方差貢獻率為20.343%，前兩個主成分的累積方差貢獻率為90.08%，故前兩個主成分基本反映了所有數據的信息量(90.08%＞80%)。

通過主成分分析，將原有的131個組分，減少到2個主成分，從而使引起不同植物源蜂膠揮發性成分差異的多維數據降到二維，差異更加明顯化。利用這種數據處理方法，可以進一步建立不同植物源蜂膠的識別模式。對4種不同植物源的蜂膠主成分分析結果見圖2，識別指數(DI)達到97(滿分為100)，表明這4種蜂膠樣品差異較大，通過PCA能將其區分開。

式中：Si代表各組樣本的表面積；S總代表所有樣本的總面積。

結合原始數據與主成分分析結果，在所列的區分四種蜂膠樣品的揮發性成分中，其中的共有組分有3-甲基-3-丁烯-1-醇、異戊二烯、4-戊烯-1-乙酸酯、梨醇酯、4-異丙基甲苯、檸檬烯、桉葉油醇、3-蒈烯、壬醛、α-古巴烯、α-依蘭油烯、去氫白菖烯、β-馬欖烯、β-桉葉醇和α-桉葉醇，它們在各樣品中的含量相差較大。還有一些組分是某樣品的特有組分，如：樣品a，17.304minα-松油烯，27.948minα-柏木烯；樣品c，25.077minα-姜黃烯，27.826minα-愈創木烯；樣品d，23.547min石竹烯，28.779minγ-依蘭油烯，31.505min苯甲酸芐酯。這些組分信息可能是區分不同膠源植物的特征信息。

3 討 論

利用SPME技術富集蜂膠中的揮發性成分，再進行GC-MS分析，方便、快捷、不消耗溶劑[10-11]，有利于提取蜂膠揮發性成分中的特征信息。4種蜂膠樣品的揮發性成分都由酸、醇、酯及烴類化合物構成，尤其是萜烯類化合物種類較多。Melliou等[6]指出希臘蜂膠抑菌活性可能與主要成分α- 蒎烯有關，徐響等[12]研究也發現蜂膠的揮發油具有抑菌作用。Popova等[13]用GC-MS分析和鑒別地中海不同地區蜂膠樣品中的二萜類化合物，并指出二萜類化合物的色譜和質譜鑒別，對于快速地構建蜂膠類型和了解其植物來源是非常有利的。本研究中所得的化合物組成與Yang等[14]報道的較為相似，但與徐響等[15]報道的北京延慶和河北唐山兩地蜂膠揮發性成分的主要貢獻化合物有差異，這很可能是由于地理位置的不同，或者膠源植物的不同所引起的。

主成分分析結果表明，植物源是影響蜂膠揮發性成分差異的主要因素。a和c蜂膠樣品都是來自甘肅省，b蜂膠樣品和d蜂膠樣品分別來自遼寧喀則和吉林敦化，但分析結果表明沒有因為地理位置的相近而其特性相近，反而是樣品c和樣品d的特性較為相近。結合主成分分析結果與原始數據，一方面可以從蜂膠的揮發性成分中提取共有的特征信息，建立指紋圖譜；另一方面可以辨出不同植物源蜂膠的特有信息，幫助快速準確的識別植物源。

本研究用HS-SPME-GC-MS分析4種不同植物源蜂膠的揮發性成分，其構成主要是醇、酯及烴類化合物，尤其是萜烯類化合物種類較多，不同植物源的蜂膠其含量相對較高的化合物類型并不相同。結合主成分分析，不同植物源的蜂膠樣品揮發性成分確實有差異，且造成差異的因素一是共有組分的含量差異，另一方面是特有組分的顯示，這些結果有利于提取其特征信息，進行指紋圖譜及區分模型的研究。

[1] NY 5136 — 2002 無公害食品∶ 蜂膠[S].

[2] BANKOVA V. Chemical diversity of propolis and the problem of standardization[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2005, 100(1/2)∶ 114-117.

[3] MARCUCCI M C. Propolis∶ chemical composition, biological properties and therapeutic activity[J]. Apidologie, 1995, 26(2)∶ 83-99.

[4] BANKOVA V, de CASTRO S L, MARCUCCI M C. Propolis∶ recent advances in chemistry and plant origin[J]. Apidologie, 2000, 31(1)∶ 3-15.

[5] 李雅萍, 賀麗萍, 陳玉芬, 等. SPME-GC/MS聯用技術分析蜂膠中揮發性成分的研究[J]. 現代食品科技, 2007, 23(7)∶ 78-80.

[6] MELLIOU E, STRATIS E, CHINOU I. Volatile constituents of propolis from various regions of Greece-antimicrobial activity[J]. Food Chemistry, 2007, 103(2)∶ 375-380.

[7] 曾晞, 盧玉振, 牟蘭等. GC-MS法分析比較貴州不同產地蜂膠揮發油化學成分[J]. 生命科學儀器, 2004(2)∶ 28-29.

[8] 許祿, 邵學廣. 化學計量學方法[M]. 2版. 北京∶ 科學出版社, 2004∶130-137.

[9] SOLA L C , NAVARRO B I. Chemometric analysis of minerals and trace elements in raw cow milk from the community of Navarra, Spain[J]. Food Chemistry, 2009, 112(1)∶ 189-196 .

[10] MAZIDA M M, SALLEH M M, OSMAN H. Analysis of volatile aroma compounds of fresh chilli (Capsicum annuum) during stages of maturity using solid phase microextraction(SPME)[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2005, 18(5)∶ 427-437.

[11] 吳繼紅, 張美莉, 陳芳, 等. 固相微萃取GC-MS法測定蘋果不同品種中主要芳香成分的研究[J]. 分析測試學報, 2005, 24(4)∶ 101-104.

[12] 徐響, 董捷, 丁小宇, 等. 不同方法萃取蜂膠揮發油組成及抑菌作用的研究[J]. 食品科學, 2010, 31(3)∶ 60-63.

[13] POPOVA M P, GRAIKOU K, CHINOU I, et al. GC-MS profiling of diterpene compounds inMediterranean propolisfrom Greece[J]. Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(5)∶ 3167-3176.

[14] YANG Chao, LUO Liping, SONG Huanlu, et al. Common aroma-active components of propolis from 23 regions of China[J]. Society of Chemical Industry, 2010, 90(7)∶ 1268-1282.

[15] 徐響, 董捷, 李潔. 固相微萃取與GC-MS法分析蜂膠中揮發性成分[J]. 食品工業科技, 2008, 29(5)∶ 57-60.

Difference in Volatile Compounds of Propolis from Different Plant Sources

YAN Sha，ZHANG Hong-chenge，DONG Jie*
(National Research Center of Bee Product Processing, Ministry of Agriculture, Institute of Apicultural Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

Propolis is a sticky dark-colored material. Its pharmacological activity and chemical compositions are highly variable,which depends on the plant sources. Solid phase microextraction coupled with GC-MS was used to analyze the volatile compounds in propolis from 4 types of plant sources. The results of principal component analysis (PCA) revealed the difference of volatile compounds in different plant sources. The same components included 3-methyl-3-butene-1-ol, isoprene,4-pentene-acetate, prenyl acetate, 4-cymene, limonene, cineole, 3-carene, nonanal,α-cubaene,α-muurolene,β-eudesmol andα-eudesmol. This study will provide a theoretical reference for further investigation of fingerprints and distinguish diagram of propolis.

propolis；plant source；volatile compounds；solid phase microextraction (SPME)；principal component analysis (PCA)

S896

A

1002-6630(2012)10-0268-06

2011-05-06

國家蜂產業技術體系資助項目(CARS-45-KXJ18)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAD33B04)

延莎(1986—)，女，碩士研究生，主要從事功能食品研究。E-mail：yansha052@126.com

*通信作者：董捷(1966—)，女，研究員，碩士，主要從事功能食品研究。E-mail：jiedon@126.com