HPLC法測定茶樹花中可溶性糖、兒茶素和游離氨基酸

徐人杰，王 琳，汪名春，葉 紅，屠幼英，曾曉雄,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院茶學(xué)系，浙江 杭州 310029)

HPLC法測定茶樹花中可溶性糖、兒茶素和游離氨基酸

徐人杰1，王 琳1，汪名春1，葉 紅1，屠幼英2，曾曉雄1,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院茶學(xué)系，浙江 杭州 310029)

采用高效液相色譜法測定茶樹(Camellia sinensis)花中可溶性糖、兒茶素和游離氨基酸的含量。結(jié)果表明：茶樹花中含有216.85mg/g可溶性糖，其花冠、雄蕊群和雌蕊群部分(F-1)及花托、萼片和花梗部分(F-2)的含量分別為250.945mg/g和112.65mg/g；茶樹花中總兒茶素含量為37.03mg/g，且F-2中的含量(46.90mg/g)高于F-1(30.88mg/g)；茶樹花中含有包括茶氨酸在內(nèi)的16種游離氨基酸，含量為10.87mg/g，雖然F-2中游離氨基酸的種類較少，但其含量(16.47mg/g)顯著高于F-1(10.59mg/g)。

茶樹花；可溶性糖；兒茶素；游離氨基酸；高效液相色譜法

茶樹花是茶樹的生殖器官之一，一般于每年5月開始花芽分化，于9—12月陸續(xù)開放。成齡茶園每畝可采鮮花200～300kg，全國茶區(qū)每年可產(chǎn)茶樹花300多萬噸，資源豐富。此外，茶樹花中含有豐富的蛋白質(zhì)、茶多糖、氨基酸等活性物質(zhì)[1-3]。因此充分利用茶樹花資源，不僅有較大的社會效益，而且有極大的經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)報道，茶樹花中有機物占17.46%，其中茶多酚、蛋白質(zhì)、茶多糖、可溶性糖、VC和氨基酸的含量分別為2.41%、4.67%、6.45%、0.63%、0.81%和0.503%[4]。董瑞建等[5]用常規(guī)水浴浸提法和超聲波輔助浸提法來提取茶樹花中的多酚，并研究了浸提溫度、時間、料液比等因素對多酚得率的影響。Yang等[6]對茶樹花的醇溶物進(jìn)行了提取分離，并測定了其抗氧化活性，結(jié)果表明兒茶素類物質(zhì)的抗氧化活性最強。陳小萍等[7]對茶樹花多糖的提取、脫色和脫蛋白工藝進(jìn)行了優(yōu)化。Yoshikawa等[8]對茶樹花的功能性皂苷類物質(zhì)進(jìn)行了分離，并研究了其在胃保護(hù)和降血糖等方面的活性。

盡管有文獻(xiàn)報道了茶樹花的主要生化成分，但對于其各組成部分的定性與定量分析鮮有報道。因此根據(jù)植物花的結(jié)構(gòu)，將茶樹花分為由花冠、雄蕊群和雌蕊群構(gòu)成的第一部分(F-1)和由花托、萼片和花梗構(gòu)成的第二部分(F-2)，并采用高效液相色譜法(high pressure liquid chromatography，HPLC)對其可溶性糖、兒茶素與游離氨基酸的含量進(jìn)行分析。通過對茶樹花中主要生化成分(可溶性糖、兒茶素和游離氨基酸)的含量測定，為茶樹花的深入研究與應(yīng)用開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

茶樹(Camellia sinensisL.)品種龍井43 的茶樹花由浙江大學(xué)茶學(xué)系提供。

蔗糖、鄰苯二甲醛(OPA)、4-苯磺酰氯和咖啡堿美國Sigma公司；果糖 美國Fluka公司；葡萄糖 德國Merck公司；表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素(C)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG) 日本Funakoshi 公司；茶氨酸日本東京化學(xué)工業(yè)公司，其他各種氨基酸 上海楷洋生物技術(shù)有限公司；乙腈和甲醇(HPLC級) 江蘇漢邦公司；(-)-表沒食子兒茶素3-O(3-O-甲基)沒食子酸酯(EGCG3"Me)和(-)-3-O-甲基-表兒茶素沒食子酸酯(ECG3'Me)根據(jù)文獻(xiàn)[9]方法制備。

1100高效液相色譜儀(配有四元泵、二極管陣列檢測器(DAD)、柱溫箱和化學(xué)工作站) 美國Agilent公司；Heidolph Laborota 4000真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph 公司；AY-120電子精密天平、BL-220H分析天平 日本Shimadzu公司；Anke TDL-5低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司；Sep-pak-C18固相萃取柱 美國Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 茶樹花的預(yù)處理

將茶樹花樣品分為F-1和F-2，然后分別用植物原料粉碎儀將茶樹花、F-1和F-2粉碎，過60目篩，置干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 可溶性糖的測定

可溶性糖的測定采用HPLC法和苯酚-硫酸法[10-12]。稱取一定量粉末樣品，加入10mL 體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液于50℃水浴中振蕩提取30min，5000r/min離心10min，傾出上清液，殘渣用同樣方法提取2次，合并3次上清液并經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙腈溶液溶解，0.45μm濾膜過濾，取濾液待用。

1.2.2.1 HPLC法

采用HPLC外標(biāo)法測定樣品中的可溶性糖含量，色譜條件：色譜柱Sugar-D(4.6mm×250mm，5μm，Nacalai Tesque Inc.)；柱溫 40℃；流動相為乙腈 -水(75∶25，V/V)；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL。

1.2.2.2 苯酚-硫酸法[12]

取經(jīng)0.45μm濾膜過濾的樣品液，按苯酚-硫酸法處理測定490nm處的吸光度。準(zhǔn)確稱取一定量的葡萄糖，溶于蒸餾水中，分別配制成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法測定吸光度并制作工作曲線。

1.2.3 兒茶素的測定

稱取一定量粉末樣品，加入10mL 50%的乙腈于30℃水浴振蕩提取40min，5000r/min離心后取上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，取濾液待用。

采用HPLC外標(biāo)法測定樣品中的兒茶素含量[13]。色譜條件：色譜柱TSKgel ODS-100Z (150mm×4.6mm，5μm，Tosoh)；柱溫40℃；梯度洗脫(流動相A：10mmol/L KH2PO4，pH2.5；流動相B：CH3OH)，洗脫時間15min，流動相B的比例由18%升至60%；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL。

1.2.4 游離氨基酸的測定

1.2.4.1 樣品的制備

游離氨基酸的測定參照Wang等[14]的方法。稱取一定量粉末樣品，加入10mL蒸餾水，沸水浴浸提20min，5000r/min離心提取上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾。取1mL濾液上Sep-pak-C18固相萃取柱，用5mL 10%乙醇洗脫，收集洗脫液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，再用1mL蒸餾水溶解，0.45μm濾膜過濾，取濾液待用。

1.2.4.2 OPA衍生化法測定游離氨基酸含量

取70μL濾液與10μL OPA(5mg OPA溶于0.05mL甲醇，再加入0.45mL 0.4mol/L硼酸緩沖液，最后加入25μLβ-巰基乙醇)衍生化試劑混合，25℃反應(yīng)2min，然后進(jìn)行色譜分析。色譜條件：色譜柱Zorbax Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm，5μm，Agilent)；柱溫：40℃；流動相A為甲醇-乙腈-水(45∶45∶10)，流動相B為磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，采用梯度洗脫(表1)；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

表1 HPLC分析流動相梯度洗脫Table 1 Elution gradient for HPLC analysis

準(zhǔn)確稱取各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，溶于一定量的蒸餾水中，分別配制成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行OPA衍生化與HPLC分析，制作工作曲線。

1.2.4.3 脯氨酸含量測定

脯氨酸含量測定采用HPLC法[15]。取50μL濾液與50μL 4-苯磺酰氯溶液(丙酮溶解，1mg/mL)混合，67℃反應(yīng)10min，HPLC分析。色譜條件：色譜柱Zorbax Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm，5μm)，柱溫30℃；流動相A為乙腈，流動相B為0.045mol/L醋酸鈉溶液(pH 4.0)；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL。準(zhǔn)確稱取脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品，溶于一定量蒸餾水中，配制成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行苯磺酰氯衍生化與HPLC分析，制作工作曲線。

1.2.5 統(tǒng)計分析方法

數(shù)據(jù)分析采用微軟Office Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹花中可溶性糖的測定

采用Sugar-D色譜柱和示差檢測器對茶樹花中的可溶性糖進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示茶樹花中可溶性糖的組分得到了有效分離(圖1)。根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)樣保留時間的比較，茶樹花中的可溶性糖主要為果糖、葡萄糖和蔗糖。此外，采用苯酚-硫酸法對茶樹花中的總可溶性糖含量進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示。

圖1 茶樹花F-1(a)和F-2(b)中可溶性糖的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of soluble sugars in F-1 (a) and F-2 (b)from tea flowers

表2 茶樹花中可溶性游離糖的含量Table 2 Content of soluble sugars in tea flowers mg/g

從表2可以看出，雖然F-1與F-2的可溶性糖的組成相同，但F-1中可溶性糖含量約是F-2的兩倍。此外苯酚-硫酸法的測定結(jié)果約是HPLC法測得結(jié)果的兩倍，這可能是茶樹花中含有可溶性多糖等成分的原因。硫酸-苯酚法可以測定總糖的含量，但不能測定各種糖的具體含量，且特異性不強，原因是受到其他可與硫酸-苯酚試劑反應(yīng)的物質(zhì)干擾，如可溶性多糖可與硫酸-苯酚發(fā)生顯色反應(yīng)，而HPLC法主要分析可溶性糖中的單糖與低聚糖，因此硫酸-苯酚法的測定值會高于HPLC法的測定值。本實驗測定了茶樹花中游離糖的種類與含量，與報道的文獻(xiàn)相比，茶樹花中可溶性糖含量(216.85mg/g)遠(yuǎn)高于茶葉(綠茶 45mg/g)[16]。

2.2 茶樹花中的兒茶素

采用TSKgel ODS-100Z色譜柱和DAD檢測器對茶樹花中的兒茶素進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果表明茶樹花中含有EGC、C、EGCG、EC、ECG、EGCG3"Me、ECG3'Me及咖啡堿(圖2)，各成分含量見表3。國立臺灣大學(xué)學(xué)者Lin等[17]分析了不同茶樹品種茶樹花的兒茶素與咖啡堿的含量，其結(jié)果與本實驗結(jié)果一致。但本實驗在茶樹花中還檢測到兩種甲基化兒茶素

圖2 茶樹花F-1(A)與F-2(B)中兒茶素的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of catechins in F-1 (A) and F-2 (B) from tea flowers

表3 茶樹花中兒茶素與咖啡堿的含量Table 3 Contents of catechins and caffeine in tea flowers

(EGCG3"Me和ECG3'Me)，其含量達(dá)1.86mg/g(F-2)。此外，值得注意的是F-1中咖啡堿的含量顯著低于F-2。據(jù)報道，兒茶素具有抗腫瘤、抗氧化、抗癌、抗心腦血管疾病等生物活性[18]，甲基化兒茶素對治療花粉過敏等過敏反應(yīng)癥有極其顯著的效果，而且它們的生物學(xué)功能己經(jīng)在體外和體內(nèi)的臨床實驗中得以證實[19]。

2.3 茶樹花中的游離氨基酸

圖3 茶樹花F-1(A)與F-2(B)中游離氨基酸的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of free amino acids in F-1 (A) and F-2 (B)from tea flowers

采用Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱和DAD檢測器對茶樹花中的游離氨基酸進(jìn)行HPLC分析，圖3表明，茶樹花中的主要游離氨基酸得到了有效的分離。由于OPA衍生化方法不能檢測脯氨酸，實驗采用苯磺酰氯衍生化方法分析了茶樹花中的游離脯氨酸，結(jié)果表明茶樹花中含有游離的脯氨酸(圖4)。根據(jù)各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣的保留時間，實驗發(fā)現(xiàn)茶樹花中含有16種游離氨基酸，其中15種為蛋白質(zhì)氨基酸和1種非蛋白質(zhì)氨基酸(茶氨酸)，而且F-1與F-2的游離氨基酸組成基本相同。

根據(jù)各氨基酸的工作曲線，對茶樹花中的游離氨基酸的含量進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。茶樹花中茶氨酸(4.93mg/g)、組氨酸(2.14mg/g)、脯氨酸(1.28mg/g)的含量較高；F-1與F-2相比，F(xiàn)-1中含有較多的脯氨酸(2.15mg/g)，而F-2中茶氨酸(5.94mg/g)、組氨酸(5.57mg/g)、谷氨酸(1.42mg/g)和精氨酸(1.12mg/g)的含量較高。

圖4 茶樹花F-1(a)與F-2(b)中游離脯氨酸的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatograms of free proline in F-1 (A) and F-2 (B)from tea flowers

表4 茶樹花中游離氨基酸的含量Table 4 Contents of free amino acids in tea flowersmg/g

茶氨酸是茶葉和部分山茶科植物特有的酰胺類物質(zhì)，也是重要的功能成分。茶氨酸具有抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)、增強記憶、抗糖尿病、降血壓、抗疲勞、緩解抑郁癥、保護(hù)心腦血管、減輕酒精對肝臟的傷害、增強對流行性感冒病毒疫苗的免疫響應(yīng)等生理作用[20]。與茶葉相比，茶樹花中茶氨酸的含量(4.93mg/g)高于茶葉中的含量(1.62～4.12mg/g)[14-15]。

3 結(jié) 論

本研究采用HPLC法對茶樹花的主要生化成分(可溶性糖、兒茶素、咖啡堿和游離氨基酸)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，結(jié)果表明茶樹花含有兒茶素和茶氨酸等生理活性物質(zhì)，而且茶氨酸等活性成分的含量較高。因此，鑒于我國豐富的茶樹花資源，茶樹花應(yīng)是一種極具開發(fā)利用價值的茶葉副產(chǎn)物。

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Determination of Soluble Sugars, Catechins and Free Amino Acids in Tea Flowers by High Performance Liquid Chromatography

XU Ren-jie1，WANG Lin1，WANG Ming-chun1，YE Hong1，TU You-ying2，ZENG Xiao-xiong1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；
2. Department of Tea Science, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

The contents of soluble sugars, catechins and free amino acids in tea flowers fromCamellia sinensiswere analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that tea flowers contained 216.85 mg/g soluble free sugars. Meanwhile, the contents of soluble sugars in corolla, stamen and pistil (F-1) and receptacle, sepal and pedicel (F-2) were 250.945 mg/g and 112.65 mg/g, respectively. Tea flowers contained 37.03 mg/g catechins. In addition, the content of catechins in F-2 was 46.90 mg/g, which was higher than that in F-1 (30.88 mg/g). Tea flower contained 16 kinds of free amino acids, and the content of total free amino acids was 10.87 mg/g. Although only 13 kinds of free amino acids were detected in F-2,its content (16.47 mg/g) was notably higher than that in F-1 (10.59 mg/g).

tea flower；soluble sugar；tea catechins；free amino acid；high performance liquid chromatography (HPLC)

Q946.3

A

1002-6630(2012)10-0246-05

2011-12-20

江蘇省科技支撐項目(BE2010346)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目

徐人杰(1985—)，男，碩士，研究方向食品生物技術(shù)。E-mail：xurenjie0623@163.cn

*通信作者：曾曉雄(1964—)，男，教授，博士，研究方向食品生物技術(shù)。E-mail：zengxx@njau.edu.cn