有機溶劑沉淀法提取乳酸鏈球菌素的效果

魯吉珂，黎業娟，吳霄玥，劉 欣，郝利民

(1.鄭州大學生物工程系，河南 鄭州 450001；2.鄭州奇泓生物科技有限公司，河南 鄭州 450066；3.總后勤部軍需裝備研究所，北京 100010)

有機溶劑沉淀法提取乳酸鏈球菌素的效果

魯吉珂1，黎業娟1，吳霄玥1，劉 欣2，郝利民3

(1.鄭州大學生物工程系，河南 鄭州 450001；2.鄭州奇泓生物科技有限公司，河南 鄭州 450066；3.總后勤部軍需裝備研究所，北京 100010)

利用水微溶性有機溶劑二氯甲烷、正丁醇，采用沉淀法從發酵濃縮液中提取乳酸鏈球菌素。結果表明：在有機溶劑和發酵濃縮液體積比1:1條件下，丁醇提取乳酸鏈球菌素純度可達到63.32%，單步沉淀收率24.3%，二氯甲烷提取產品純度39.96%，沉淀收率36.04%；二氯甲烷和丁醇體積比1:1組成的復合溶劑，提取效果優于單一有機溶劑，產品純度和單步收率分別為45.94%和59.3%。該方法可克服現有乳酸鏈球菌素提取工藝產品純度低、鹽含量高的缺陷，具有過程簡便、產品純度較高的優點，具有較好的工業化應用前景。

沉淀；有機溶劑；乳酸鏈球菌素；發酵濃縮液；分離

乳酸鏈球菌素(Nisin)又稱乳球菌肽或乳鏈菌肽，是乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)在代謝過程中產生的具有很強殺菌作用的多肽，一級結構由34個氨基酸組成，相對分子質量約為3500，通常以二聚體形式存在[1]。Nisin是一種天然食品防腐劑，具有抗菌性強、無毒、水溶性好、熱穩定性好等優點，已被廣泛應用于乳制品、罐頭食品、肉制品和飲料的防腐保鮮[2]。

目前，工業上Nisin主要是采用發酵法生產。目前從發酵液中提取Nisin的方法主要有吸附法、鹽析法、膜過濾法、有機溶劑法、泡沫分離法和雙水相萃取法等[3-7]。吸附法是在發酵液中加入固體吸附劑如大孔樹脂或者利用菌體細胞自身吸附乳酸鏈球菌素，解吸后將解吸液鹽析或噴霧干燥，制成粉末狀食品級Nisin產品[8]；膜過濾法首先用無機膜或管式膜從發酵液中除去菌體和固體等相對分子質量比乳酸鏈球菌素大的物質，再采用卷式膜超濾從發酵液中除去相對分子質量比乳酸鏈球菌素小的物質，得到發酵液濃縮物，最后加入固體食鹽，經噴霧干燥制得食品級Nisin，產品中食鹽含量為10%～50%[9]；有機溶劑法主要采用正丙醇和丙酮，將一定量正丙醇加入NaCl飽和的預處理后發酵液中，離心，上清液加入丙酮沉淀，冷凍干燥即得Nisin粉末[5]。也有文獻[10-11]報道采用層析的方法純化Nisin，采用G50介質的凝膠過濾層析，或者采用陽離子交換樹脂D113的離子交換層析。

綜上所述，目前Nisin的提取工藝主要采用的是鹽析和噴霧干燥的方式，產品中以粉末狀食品級Nisin為主，質量標準參照GB 2394—2007《食品添加劑：乳酸鏈球菌素》，產品效價不低于900IU/mg，NaCl含量不低于50%。由于鹽含量高、純度較低，并且提取步驟繁瑣，純化過程復雜，提取成本較高。Nisin層析工藝得到的產品純度較高，但目前仍處于實驗室研究階段，成本和放大問題成為制約其工業化應用的主要瓶頸[12]。

傳統有機溶劑法分離Nisin采用水溶性的正丙醇和丙酮，本研究提出的有機溶劑沉淀法利用微溶于水的有機溶劑回收高純度Nisin，以發酵濃縮液為原料，制備含鹽量低的高純度Nisin制品，該方法目前尚未見文獻報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Nisin發酵濃縮液(效價為51.8×104IU/mL) 鄭州奇泓生物科技有限公司；Nisin標準品 美國Sigma公司；丁醇、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、丙醇、四氯化碳、正己烷均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 有機溶劑沉淀

取一定體積有機溶劑(或者一定比例混合的兩種有機溶劑)，和一定體積Nisin發酵濃縮液置于分液漏斗中，混合均勻，3500r/min離心分層，水層和有機溶劑相分離，分別測量清液體積及效價，沉淀置于50℃真空干燥，測定質量及效價。

1.2.2 Nisin效價測定

瓊脂擴散法測定效價(GB 2394—2007)[13]。

2 結果與分析

有機溶劑沉淀法是向蛋白質溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有機溶劑，水的活度降低，水對蛋白表面荷電基團或親水基團的水化程度降低，溶液介電常數下降，蛋白質分子間靜電引力增加，從而凝聚和沉淀[14]。Nisin是兩性分子，具有傾向于膜蛋白的性質，可在有機相和水相的交界處富集濃縮[15]。本研究所選用的有機溶劑從疏水性較強的正己烷(疏水常數logP為3.5)，到親水性較強的乙醇(logP為－0.24)，一共8種，見表1。

表1 不同有機溶劑疏水常數logP值[16]Table 1 Hydrophobic constant (log P values) of different organic solvents

2.1 單一有機溶劑沉淀Nisin

首先采用單一有機溶劑沉淀法(表1)，對Nisin發酵濃縮液進行提純，結果見表2。由表2可知，在有機溶劑與發酵濃縮液體積比為1:1的條件下，二氯甲烷和丁醇的提取效果較好：丁醇提取沉淀Nisin純度可達63.32%，單步沉淀收率為24.3%，二氯甲烷提取沉淀純度雖僅為39.96%，但沉淀收率為36.04%；四氯化碳沉淀Nisin收率較低，不到10%(表2)；將發酵濃縮液與丙酮、乙醇、丙醇、乙酸乙酯和正己烷按照體積1:1的比例分別混合均勻，均沒有沉淀生成。綜合沉淀收率和Nisin純度兩項指標，二氯甲烷和丁醇兩種溶劑對Nisin的沉淀提取效果較好，而與其疏水常數相近的乙酸乙酯對Nisin沒有沉淀作用；正己烷雖可與發酵濃縮液形成明顯分層，但其對Nisin的沉淀效果不太理想(沒有沉淀生成)。上述結果表明：溶劑疏水性差異可能不是決定Nisin分離提取的主要因素，而Nisin在有機相和水相的交界處富集濃縮存在溶劑特異性。

表2 單一有機溶劑沉淀Nisin實驗結果Table 2 Nisin precipitation results with single organic solvent

2.2 增加有機溶劑用量沉淀Nisin

根據單一有機溶劑的實驗結果，選取二氯甲烷和丁醇為沉淀溶劑，增加其用量進行Nisin提取實驗，結果見表3。對二氯甲烷沉淀體系，增加二氯甲烷用量至發酵濃縮液體積2倍時，沉淀Nisin純度為42.95%，此時單步沉淀收率為47.7%；和二氯甲烷與Nisin濃縮液體積比為1:1時相比，產品純度略有提高；而增加丁醇用量至發酵濃縮液體積2倍時，Nisin純度反而降低，由63.32%降至54.42%，但單步沉淀收率由24.3%升至43.5%。考慮到實際應用中增加溶劑用量會增加后續溶劑回收成本，因此選用有機溶劑與發酵濃縮液體積比為1:1的比例進行Nisin沉淀提取。

表3 增加有機溶劑用量沉淀Nisin實驗結果Table 3 Nisin precipitation results with increased organic solvent amount

2.3 復合有機溶劑沉淀

表4 復合有機溶劑沉淀Nisin結果Table 4 Nisin precipitation results with complex organic solvents

根據單一有機溶劑實驗結果，選取二氯甲烷和丁醇為基礎溶劑，分別將其與短鏈醇類、丙酮和乙酸乙酯組成體積比1:1的復合溶劑，再進行Nisin沉淀提取實驗，結果見表4。其中二氯甲烷的上述復合溶劑，同Nisin發酵濃縮液混合離心后均分為3層，中間層為褐色沉淀：二氯甲烷和乙醇復合溶劑提取Nisin純度最高，可達79.49%，但單步沉淀Nisin收率較低，僅為14.4%；結合收率和產品純度兩項指標綜合考察，二氯甲烷和丁醇復合溶劑提取效果較好，產品純度和單步收率分別為45.94%和59.3%。丁醇同甲醇、乙醇和丙酮組成的復合溶劑，同Nisin發酵濃縮液混合后不分層也無沉淀；丁醇和丙醇混合溶劑僅有微量沉淀；丁醇和乙酸乙酯混合溶劑提取Nisin對應的產品純度和單步收率分別為54.64%和45.7%。上述實驗結果說明：選用合適的復合有機溶劑會得到比單一溶劑更優的Nisin分離提純效果；采用簡單的有機溶劑沉淀方法可以得到純度較高的Nisin產品(接近80%)；有機溶劑及其復合有機溶劑的選用對Nisin產品的純度和收率均有顯著影響。

3 結 論

針對現有Nisin提取工藝存在的成品鹽含量高、提取工藝復雜、提取成本偏高的問題，提出了采用有機溶劑沉淀法提純Nisin的新工藝。利用水微溶性有機溶劑二氯甲烷和丁醇，從Nisin發酵濃縮液中提取純度較高的Nisin制品，具有過程簡便、產品純度較高等優點。在二氯甲烷和乙醇體積比1:1混合為復合溶劑條件下，提取Nisin沉淀純度可達79.49%。盡管單步沉淀收率不高，但下一步可采用多步沉淀的方式來提高分離純化的總收率。該課題的進一步研究開發，將具有較好的工業化應用前景。

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Separation of Nisin from Fermentation Broth Concentrate by Organic Solvent Precipitation

LU Ji-ke1，LI Ye-juan1，WU Xiao-yue1，LIU Xin2，HAO Li-min3
(1. Department of Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China；2. Zhengzhou Qihong Biotechnology Co. Ltd., Zhengzhou 450066, China；3. Quartermaster Equipment Institute of General Logistics Department of People,s Liberation Army, Beijing 100010, China)

To obtain high purity nisin product through simple process with low cost, nisin was precipitated from fermentation broth concentrated with organic solvents dichloromethane andn-butanol. Under 1:1 (V/V) conditions with butanol employed, the nisin purity was 63.32%, and the precipitation yield was 24.3%. While the purity and yield for dichloromethane was 39.96%and 36.04%, respectively. When a mixture of dichloromethane and butanol at a volume ratio of 1:1 was used, the nisin purity and the precipitation yield was 45.94% and 59.3%, respectively. This new method overcame many disadvantages of the existing method, such as low purity and high salt content. So it shows great potential for industrial applications.

precipitation；organic solvent；nisin；fermentation broth concentrate；separation

TQ465.92

A

1002-6630(2012)10-0084-03

2011-11-07

鄭州大學引進人才項目；鄭州大學全國大學生創新創業訓練計劃項目(121045943)；河南省教育廳科學技術研究重點項目(12B530005)

魯吉珂(1982—)，男，講師，博士，主要從事功能食品開發研究。E-mail：ljk002004@163.com