不同生長階段鹿茸中膠原含量比較及提取條件優(yōu)化

趙玉紅，金秀明，王珊珊

(東北林業(yè)大學林學院食品科學系，黑龍江 哈爾濱 150040)

不同生長階段鹿茸中膠原含量比較及提取條件優(yōu)化

趙玉紅，金秀明，王珊珊

(東北林業(yè)大學林學院食品科學系，黑龍江 哈爾濱 150040)

以梅花鹿鹿茸為原料，研究不同生長階段鹿茸中膠原含量及膠原提取效果并確定適宜提取條件。采用胃蛋白酶法提取膠原，采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計優(yōu)化膠原提取條件。結(jié)果表明：二杠茸中膠原含量和得率均高于毛桃茸和三杈茸，分別為65.8mg/g和4.53%；膠原提取適宜工藝條件為提取時間52h、酶用量5%、液料比23:1(mL/g)，在此條件下鹿茸膠原得率為5.92%。

鹿茸；膠原；提取；優(yōu)化

膠原是一種結(jié)構(gòu)蛋白，呈纖維狀，是動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)。存在于結(jié)締組織、皮膚、骨骼、內(nèi)臟細胞間質(zhì)及肌腔、韌帶等部位，具有支撐器官、保護機體的功能[1]。研究表明膠原具有其他物質(zhì)不可比擬的低抗原性、生物相容性和降解性[2]，與人體生長、衰老息息相關(guān)，被廣泛用于化妝品、生物醫(yī)學、制藥和食品等領(lǐng)域[3-4]。目前，生產(chǎn)膠原的原料主要是陸生哺乳動物(以豬、牛為主)的皮和骨，但因安全性和宗教禁忌等問題，制品的應用范圍受到限制，因此，國際上膠原的提取開始轉(zhuǎn)向從海洋等水生動物中提取。鹿茸是鹿科動物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[5]，其在醫(yī)藥領(lǐng)域備受青睞。《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載鹿茸“味甘、性溫、主漏下惡血，寒熱驚痢，益氣強志，生齒不老”[6]。對多種鹿茸品系中化學成分的分析表明，鹿茸中粗蛋白質(zhì)含量占干質(zhì)量50%以上，而膠原是鹿茸中含量最高的蛋白質(zhì)[7]。鹿茸不僅具有生長速度快、可再生的特點，而且具有廣泛藥理作用，因此鹿茸作為膠原提取原料不僅具有其他原料無法比擬的特點，而且可作為陸生動物源膠原蛋白的有益補充。李銀清等[8]采用醇提法制備鹿茸膠原對大鼠成骨細胞有明顯的促貼壁和增殖作用，對去勢雌性大鼠骨質(zhì)疏松癥具有一定的治療作用。徐云鳳等[9]采用胰蛋白酶水解制備鹿茸膠原蛋白，并正交優(yōu)化提取條件得膠原收率為12.52%。本實驗采用胃蛋白酶法提取鹿茸膠原，比較不同生長階段鹿茸中膠原含量的差異，并對胃蛋白酶法提取鹿茸膠原的工藝條件進行優(yōu)化，為鹿茸膠原的研究和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梅花鹿茸(毛桃、二杠、三杈茸) 黑龍江省大莊園集團；胃蛋白酶、MD-44透析袋 美國Sigma公司；L-羥脯氨酸 北京索萊寶生物科技有限公司；冰乙酸、NaCl(均為分析純) 南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C數(shù)顯pH計 上海雷磁儀器廠；TDA-8002數(shù)顯恒溫水浴鍋 蘇州威爾實驗用品有限公司；TDL-5LM-W低溫離心機 湖南星科科學儀器有限公司；722可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；ALPHA1-2真空冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 膠原的提取純化

工藝流程：鮮鹿茸→預處理→鹿茸粉末→胃蛋白酶法提取膠原→鹽析→透析→冷凍干燥→鹿茸膠原。

取一定量鹿茸粉末，用10倍體積的0.1mol/L NaOH溶液4℃浸泡24h，蒸餾水洗至中性。固形物溶于0.5mol/L醋酸溶液，加入一定量胃蛋白酶，4℃條件下提取72h，10000r/min低溫離心20min，上清液于4℃保存?zhèn)溆谩Ｋ贸恋碇貜吞崛纱巍：喜⑸锨逡海礊槁谷啄z原粗提液。向膠原粗提液中加入氯化鈉至濃度為2mol/L，鹽析過夜，10000r/min低溫離心30min，棄去上清液，將析出的膠原液移入透析袋中，透析48h[10-11]。冷凍干燥，得鹿茸膠原。

1.3.2 鹿茸中膠原含量及得率測定

羥脯氨酸是膠原的特征氨基酸，通過測定羥脯氨酸的含量，并乘以相應的系數(shù)就可以求得膠原的含量[12]。故可采用比色法測定鹿茸中的羥脯氨酸含量來計算膠原的含量。鹿茸中羥脯氨酸約占膠原總量的10%[8]，因此本實驗中換算系數(shù)為10。

1.3.2.1 羥脯氨酸標準曲線的繪制

配制羥脯氨酸標準溶液質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL。取不同質(zhì)量濃度的上述溶液各4.00mL，加入20mL具塞試管中。加氯胺T溶液2mL，搖勻后于室溫放置20min。加入顯色劑2mL，搖勻，塞上塞子于60℃恒溫水浴中保溫20min后取出，迅速冷卻，在波長560nm處測定吸光度。蒸餾水作為空白對照[13]，得標準曲線：y＝0.0815x＋0.0004，R2＝0.9986。

1.3.2.2 鹿茸中膠原含量測定

取樣品溶液4mL至試管中，加入6mol/L的鹽酸4mL，在酒精噴燈上封口，放入110℃恒溫干燥箱中水解24h，冷卻。取4mL分別加入20mL具塞試管中，加氯胺T溶液2mL，搖勻后于室溫放置20min。加入顯色劑2mL，搖勻，塞上塞子于60℃恒溫水浴中保溫20min后取出，迅速冷卻，在波長560nm處測定吸光度。根據(jù)回歸方程計算出樣品中羥脯氨酸含量，并由樣品中羥脯氨酸含量計算樣品中膠原含量，公式如下[14]：

式中：A為標準曲線測得的溶液中羥脯氨酸的含量/(μg/mL)；m為取樣品的質(zhì)量/g；10為膠原水解為羥脯氨酸的系數(shù)。

1.3.2.3 鹿茸膠原得率計算

根據(jù)1.3.2.2節(jié)所得鹿茸中膠原含量，計算膠原得率。

1.3.3 鹿茸膠原提取的單因素試驗

分別選取提取時間、酶用量和液料比進行單因素試驗，在其他因素相同情況下，考察某一因素對鹿茸膠原提取率的影響。固定項為提取時間48h、酶用量5%、液料比20:1(mL/g)。提取時間分別為12、24、36、48、60h；酶用量分別為3%、4%、5%、6%、7%；液料比分別為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1(mL/g)。

1.3.4 鹿茸膠原提取條件優(yōu)化

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，選取提取時間、液料比和酶用量進行二次旋轉(zhuǎn)多元回歸試驗，獲得最佳提取條件，因素水平見表1。

表1 二次旋轉(zhuǎn)多元回歸試驗因素和水平編碼值Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)重復測定3次，所得結(jié)果為“平均值±標準差”，采用Excel 2003及SAS 9.0數(shù)學統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長階段鹿茸膠原含量比較

通過測定鹿茸中羥脯氨酸的含量計算鹿茸不同生長階段膠原的含量，同時，根據(jù)1.3.2.3節(jié)方法計算出不同生長階段膠原得率，結(jié)果如表2、3所示。表2 不同生長階段鹿茸中膠原含量

Table 2 Collagen contents of velvet antlers at different growth stages

注：肩標字母不同表示差異顯著(P＜0.05)。下同。

表3 不同生長階段鹿茸中膠原得率Table 3 Collagen yields of velvet antlers at different growth stages

由表2可知，二杠茸中膠原含量最多，毛桃茸次之，三杈茸膠原含量最少，且二杠茸與毛桃和三杈茸中膠原含量差異顯著(P＜0.05)。由表3可知，不同生長階段鹿茸膠原得率與膠原含量變化趨勢相同，可推斷鹿茸膠原提取效率沒有受到不同階段鹿茸原料差異的影響，不同生長階段鹿茸結(jié)構(gòu)沒有影響提取效果。因此，在膠原提取工藝的研究上，二杠茸更為適合。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取時間對膠原得率的影響

圖1 提取時間對鹿茸膠原得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on yield of antler collagen

由圖1可知，提取時間為48h時，膠原得率最高。當提取時間小于48h時，酶解反應不完全，膠原未全部溶于水中，得率隨提取時間增加而增加；當提取時間大于48 h時，酶反應過度，部分蛋白質(zhì)分解成氨基酸，使膠原得率下降[15]。所以提取時間采用48h。

2.2.2 酶用量對膠原得率的影響

圖2 酶用量對鹿茸膠原得率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on yield of antler collagen

如圖2可知，隨著酶用量的增加，得率不斷增大，當酶用量大于5%時，得率基本不變。這是由于，酶用量為5%時，原料中膠原基本全部溶出，此后，增加酶用量得率也不會繼續(xù)上升。因此，為節(jié)省試驗成本，酶用量選擇5%。

圖3 液料比對鹿茸膠原得率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on yield of antler collagen

2.2.3 液料比對膠原得率的影響由圖3可知，當液料比小于20:1(mL/g)時，隨著提取液增加，膠原得率呈上升趨勢；當液料比為20:1時，得率達到最大，此后，隨著提取液體積增加，得率變化不大。這是由于當液料比為20:1時，相同溶解狀態(tài)下，膠原已基本全部溶出，再增加提取液的量不會使得率增加。因此，為提高試驗效率，液料比確定為20:1。

2.3 膠原提取條件優(yōu)化

2.3.1 Box-Behnken試驗結(jié)果及分析

表4 Box-Behnken試驗分析方案及結(jié)果Table4 Box-Behnken design and experimental results

根據(jù)表4數(shù)據(jù)，以膠原得率為響應值，運用SAS 9.0數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進行響應面分析，因子經(jīng)回歸擬合得回歸方程，其顯著分析及方差分析分別見表5、6。

表5 回歸系數(shù)顯著性分析Table 5 Significant regression coefficient analysis

由表5可知，方程一次項X1和X2顯著，X3影響不顯著，說明各因素中，提取時間和酶用量對膠原得率影響較大，液料比對膠原得率影響不大。二次項均顯著，交互項中，X1X3、X2X3影響顯著，X1X2影響不顯著，說明各試驗因素對響應值不是簡單的線性關(guān)系，而是呈二次拋物面關(guān)系。同時，可得出各因素對鹿茸膠原得率的影響順序為提取時間＞酶用量＞液料比。

由表6可知，模型回歸極顯著(P＜0.0001)，R2＝97.55%，說明該回歸方程擬合較好，自變量與響應值之間線性關(guān)系顯著，可用于試驗理論預測。失擬為0.7224＞0.05，不顯著。表明該方程試驗誤差小，可用此模型對回歸方程進行檢驗。

2.3.2 響應面圖形分析

圖4 各兩因素交互作用對鹿茸膠原得率影響的響應面圖Fig.4 Response surface plots of collagen yield and enzyme addition,liquid-solid ratio

由圖4a可知，提取時間和酶用量對鹿茸膠原得率的影響均呈拋物線形，隨著提取時間和酶用量同時增大，膠原得率呈先增加后降低的趨勢，即在提取工藝中適當增加提取時間和酶用量可以提高膠原得率。同時，提取時間曲面斜率大于酶用量曲面斜率，可知提取時間對膠原得率的影響大于酶用量。由圖4b可知，隨著提取時間和液料比增加，膠原得率達到最大值，此后隨著兩者的增加，得率有所下降。因此，應選取合適的提取時間和液料比。提取時間曲面斜率大于液料比，可知提取時間對膠原得率的影響大于液料比。由圖4c可知，酶用量和液料比在分別達到某一點后，膠原得率變化不明顯，所以控制酶用量和液料比在最佳范圍。

對回歸方程求一階偏導，求得最佳點編碼值分別為X1＝0.6768、X2＝－0.1740、X3＝0.6885，理論最佳值為提取時間52.06h、酶用量4.91%、液料比23.44:1(mL/g)。鹿茸膠原得率理論預測值可達到6.02%。考慮到實際操作條件，最佳試驗條件確定為提取時間52h、酶用量5%、液料比23:1(mL/g)。在此條件下進行驗證實驗，膠原得率為5.92%。可見，試驗結(jié)果與模型擬合良好，該方程能真實地反應各因素對膠原得率的影響。

3 結(jié) 論

本實驗采用胃蛋白酶法提取鹿茸膠原，比較不同生長階段鹿茸中膠原含量和膠原得率，證明二杠茸高于毛桃茸和三杈茸(P＜0.05)，更適合作為鹿茸膠原提取的原料。采用響應面法優(yōu)化二杠鹿茸膠原提取條件，確定適宜提取工藝條件為提取時間52h、酶用量5%、液料比23:1(mL/g)，在此條件下膠原得率為5.92%。

[1] 鐘朝輝, 李春美, 梁晉鄂, 等. 魚鱗膠原蛋白提取工藝的優(yōu)化[J]. 食品科學, 2006, 27(7): 162-166.

[2] 鄭淼, 周亞丹, 趙敏. 東北林蛙皮中膠原蛋白含量的測定及提取工藝[J]. 東北林業(yè)大學學報, 2008, 36(7): 81-83.

[3] 錢麗麗, 高學敏, 王淳. 具有中醫(yī)特色的保健食品研發(fā)優(yōu)勢分析[J].中華中醫(yī)藥雜志, 2009, 24(6): 697-701.

[4] OGAWA M, PORTIER R J, BELL J, et al. Biochemical properties of bone and scale collagens isolated from the subtropical fish black drum(Pogonia cromis) and sheephead seabream (Archosargus probatocephalus)[J]. Food Chemistry, 2004, 88(4): 495-50.

[5] 齊艷萍. 鹿茸的化學成分及對肝損傷的修復作用[J]. 甘肅中醫(yī), 2010,23(1): 61-63.

[6] 晉大鵬, 胡志帥, 陳書明. 鹿茸的化學成分及其生物活性研究進展[J]. 山西中醫(yī)學院學報, 2009, 10(2): 67-68.

[7] BYONGTAE J, SUNGJIN K, SANGMOO P, et al. Effect of antler growth period on the chemical composition of velvet antler in sika deer(Cervus nippon)[J]. Mammalian Biology, 2008, 74(5): 374-380.

[8] 李銀清. 梅花鹿茸膠原的分離提取及活性研究[D]. 長春: 長春中醫(yī)藥大學, 2007.

[9] 徐云鳳, 趙雨, 張鶴, 等. 酶解法制備鹿茸膠原蛋白的工藝研究[J].中華醫(yī)藥雜志, 2011, 26(1): 53-55.

[10] 張文濤. 霞水母中膠原蛋白的分離及理化活性初探[D]. 無錫: 江南大學, 2008.

[11] 莊永亮, 趙雪, 張朝輝, 等. 海蜇傘布膠原蛋白的提取及其理化性質(zhì)[J]. 食品科學, 2009, 30(13): 89-92.

[12] LIN Y K, LIN T Y, SU H P. Extraction and characterization of telopeptidepoor collagen from porcine lung[J]. Food Chemistry, 2011, 124(4):1583-1588.

[13] 王紅道, 鄭云峰, 黃曉麗, 等. 比色法測定乳制品中羥脯氨酸含量[J].科技信息, 2009(25): 422-423.

[14] 劉磊. 海蜇膠原蛋白的提取、純化及理化性質(zhì)研究[D]. 無錫: 江南大學, 2009.

[15] 馬儷, 王曉丹, 程賀, 等. 響應面法優(yōu)化酶法提取鱈魚皮中膠原蛋白條件[J]. 中國釀造, 2010(9): 83-85.

Collagen Content of Velvet Antlers at Different Growth Stages and Optimization of Extraction Process

ZHAO Yu-hong，JIN Xiu-ming，WANG Shan-shan
(Department of Food Science, College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

Velvet antlers were selected as raw materials to extract collagen using enzyme pepsin. Collagen contents at different growth stages were also compared. Results showed that content and the yield of collagen in two branched antler were 65.8 mg/g and 4.53%, respectively, which were significantly higher than three branched antler (P＜0.05). Factors of extraction time, enzyme addition and liquid-solid ratio were chosen to research the effects on yield of collagen and Box-Behnken experiment was designed to optimize the extraction conditions. The results showed that extraction time for 52 h, enzyme addition with 5%, liquid-solid ratio at 23:1 (mL/g) were the optimal conditions, the yield of collagen in two-branched antler was 5.92%.

antler；collagen；extraction；optimization

TS201.7

A

1002-6630(2012)10-0067-05

2011-04-18

黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究指導項目(11553036)

趙玉紅(1968—)，女，副教授，博士，研究方向為林特產(chǎn)品精深加工。E-mail：zhaoyuhong08@hotmail.com