咖啡酸維生素C酯的合成、抑菌活性和抗氧化性研究

劉菊香，范廣璞，劉長春

(江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安 223003)

咖啡酸維生素C酯的合成、抑菌活性和抗氧化性研究

劉菊香，范廣璞，劉長春*

(江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安 223003)

研究了以3，4－二羥基苯甲醛、丙二酸和維生素C為原料，經(jīng)過Knoevenagel縮合和直接酯化一鍋法合成咖啡酸維生素C酯的方法，并考察了咖啡酸維生素C酯的抑菌活性和抗氧化性。在催化劑SO42－/ZrO2的作用下，3，4－二羥

基苯甲醛與丙二酸首先發(fā)生Knoevenagel縮合生成咖啡酸，產(chǎn)物不需要分離，加入維生素C繼續(xù)進(jìn)行酯化反應(yīng)，以85.1%的產(chǎn)率得到了咖啡酸維生素C酯，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)用1H NMR和IR進(jìn)行確證。抑菌活性實(shí)驗(yàn)表明，咖啡酸維生素C酯對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、釀酒酵母、青霉、黃曲霉和黑曲霉均有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)細(xì)菌和酵母的抑制作用高于霉菌。抗氧化性實(shí)驗(yàn)表明，咖啡酸維生素C酯可以有效清除DPPH自由基和羥基自由基，清除效果明顯好于維生素C。

咖啡酸維生素C酯，咖啡酸，維生素C，抑菌活性，抗氧化性

咖啡酸及其酯具有較強(qiáng)的抗菌活性、抗病毒活性、抗氧化活性和抗腫瘤作用［1－3］，藥理活性非常廣泛，是近年來新藥研發(fā)的熱點(diǎn)化合物，在醫(yī)學(xué)上具有廣闊的應(yīng)用前景。維生素C是一種人體必需的水溶性維生素，具有優(yōu)良的抗氧化性，目前廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。維生素C的水溶性和不穩(wěn)定性限制了它的應(yīng)用范圍，減弱了其使用功效。維生素C酯是維生素C的一種重要衍生物［4］，它不僅保持了維生素C的抗氧化性能和生理活性，而且在非水體系中的溶解性和穩(wěn)定性均有顯著提高，增加了對(duì)自由基的清除能力，已經(jīng)成為一種高效、安全、無毒的抗氧化劑。為了獲得一種兼具抑菌活性和抗氧化活性的多功能食品添加劑，我們?cè)O(shè)計(jì)將咖啡酸與維生素C兩個(gè)活性結(jié)構(gòu)單元相結(jié)合合成咖啡酸維生素C酯。維生素C酯的合成方法主要有化學(xué)法合成和酶法合成。傳統(tǒng)化學(xué)法合成通常以維生素C和羧酸或羧酸酯為原料，用濃硫酸作催化劑，經(jīng)直接酯化或酯交換得到維生素C酯［4－8］，反應(yīng)時(shí)間長，酯產(chǎn)率低，環(huán)境污染嚴(yán)重。酶法合成則是采用脂肪酶作催化劑合成維生素C酯［9－11］，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物選擇性高，但反應(yīng)時(shí)間長，反應(yīng)收率低，催化劑成本高。固體酸催化劑SO42－/ZrO［212］在Knoevenagel縮合反應(yīng)中得到廣泛應(yīng)用，獲得了較好的使用效果。我們已將SO42－/ZrO2用于催化Knoevenagel縮合和酯化反應(yīng)一鍋法合成α－呋喃丙烯酸丁酯［13］，催化活性高，產(chǎn)率高，選擇性好，回收處理簡單，具有良好的重復(fù)使用性能。本文以3，4－二羥基苯甲醛、丙二酸和維生素 C 為原料，SO42－/ZrO2作催化劑，經(jīng)過Knoevenagel縮合和直接酯化一鍋法合成咖啡酸維生素C酯，用1H NMR和IR對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并考察了其抑菌活性和抗氧化性。合成路線如圖1所示。

圖1 咖啡酸維生素C酯的合成Fig.1 Synthesis of caffeic acid vitamin C ester

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Nicolet 5－DX紅外光譜儀、KBr壓片 美國Nicolet公司;AVANCE 400核磁共振儀 TMS作內(nèi)標(biāo)，CDCl3作溶劑，瑞士Bruker公司;X－4型顯微熔點(diǎn)儀 北京泰克儀器有限公司;722S型分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 咖啡酸維生素C酯的合成

1.2.1.1 合成方法 在裝有回流冷凝管的三口燒瓶中，加入 3，4－二羥基苯甲醛 10mmol，丙二酸10mmol，催化劑96mg和乙腈20m L，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，攪拌回流反應(yīng)1h。加入維生素C 12mmol，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于60℃繼續(xù)反應(yīng)3h。反應(yīng)液冷卻至室溫，過濾分離出催化劑，用乙腈洗滌，可以循環(huán)使用。將濾液與洗滌液合并，依次用冰冷飽和NaHCO3溶液和冰水洗滌，用無水MgSO4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，殘留物用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到白色固體咖啡酸維生素C酯，產(chǎn)率85.1%(按3，4－二羥基苯甲醛計(jì))，m.p.192～193℃。1H NMR(CDCl3)δ:4.31～4.40(m，2H，OCH2)，4.62(t，1H，OCH)，4.86(d，1H，COOCH)，5.27(s，1H，OH)，6.34(d，1H，COCH=)，6.85～7.01(m，3H，ArH)，7.52(d，1H，=CH)，9.12(s，2H，ArOH)，10.95 (s，2H，=COH);IR(KBr，cm－1)υ:3386，2931，1728，1652，1467，1161.

1.2.1.2 反應(yīng)條件的確定

反應(yīng)物用量:固定 3，4－二羥基苯甲醛用量10mmol，催化劑用量96mg，縮合反應(yīng)時(shí)間1h，酯化反應(yīng)溫度60℃和反應(yīng)時(shí)間3h，分別改變丙二酸和維生素C用量為10、11、12、13mmol，按1.2.1.1中方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

催化劑用量:固定 3，4－二羥基苯甲醛用量10mmol，丙二酸用量10mmol，維生素C用量12mmol，縮合反應(yīng)時(shí)間1h，酯化反應(yīng)溫度60℃和反應(yīng)時(shí)間3h，改變催化劑用量為48、72、96、120mg，按1.2.1.1中方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

縮合反應(yīng)時(shí)間:固定3，4－二羥基苯甲醛用量10mmol，丙二酸用量10mmol，維生素C用量12mmol，催化劑用量96mg，酯化反應(yīng)溫度60℃和反應(yīng)時(shí)間3h，改變縮合反應(yīng)時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0h，按1.2.1.1中方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

在“您認(rèn)為您所在的區(qū)域教研組是一個(gè)什么樣的組織”一題中，62.3%的教師選擇了“非行政性學(xué)科專業(yè)組織”這一選項(xiàng)。可見，雖然教研組在學(xué)校里還承擔(dān)著一定的行政事務(wù)，但廣大教師對(duì)教研組在教學(xué)研究中發(fā)揮更大作用的期待越來越明顯。建設(shè)基于學(xué)科的區(qū)域教研不僅是新課改對(duì)于學(xué)科建設(shè)的需求，同時(shí)更是一線教師對(duì)學(xué)科教研組在其專業(yè)發(fā)展過程中發(fā)揮積極促進(jìn)作用的需求。

酯化反應(yīng)溫度:固定3，4－二羥基苯甲醛用量10mmol，丙二酸用量10mmol，維生素C用量12mmol，催化劑用量96mg，縮合反應(yīng)時(shí)間1h，酯化反應(yīng)時(shí)間3h，改變酯化反應(yīng)溫度為50、60、70、80℃，按1.2.1.1中方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

酯化反應(yīng)時(shí)間:固定3，4－二羥基苯甲醛用量10mmol，丙二酸用量10mmol，維生素C用量12mmol，催化劑用量96mg，縮合反應(yīng)時(shí)間1h，酯化反應(yīng)溫度60℃，改變酯化反應(yīng)時(shí)間為1、2、3、4h，按1.2.1.1中方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 抑菌活性的測定 選擇金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母、青霉、黑曲霉、黃曲霉等7種常見的食品致腐菌為受試菌，采用抑菌圈法測定咖啡酸維生素C酯的抑菌活性，具體測試方法見文獻(xiàn)［15］。將目標(biāo)化合物進(jìn)行倍比稀釋，根據(jù)抑菌圈的有無確定最低抑菌濃度(MIC)。根據(jù)抑菌圈直徑(D)大小計(jì)算抑制率，測試濃度為50mg/m L。

1.2.3 抗氧化性能的測定 按文獻(xiàn)［5］測定咖啡酸維生素C酯對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除活性，并與維生素C的清除活性進(jìn)行比較。測定清除羥基自由基活性時(shí)，測試濃度為1、2、4、6、8、10mmol/L，以不含樣品的溶液為對(duì)照，不含樣品和H2O2的溶液為空白。測定清除DPPH自由基活性時(shí)，測試濃度為10、20、40、60、80、100μmol/L，以不含樣品的溶液為空白。根據(jù)測得的吸光度(A)計(jì)算目標(biāo)化合物對(duì)羥基自由基和DPHH自由基的清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 咖啡酸維生素C酯的合成

考慮到乙腈的極性很強(qiáng)，對(duì)反應(yīng)物有較好的溶解性，而且其沸點(diǎn)可以滿足反應(yīng)需要，因而選擇乙腈作為反應(yīng)溶劑。Knoevenagel縮合通常在較高的溫度下進(jìn)行，加上縮合產(chǎn)物需要脫去一個(gè)羧基，所以我們選定縮合反應(yīng)在回流條件下進(jìn)行。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)物用量、催化劑用量、縮合反應(yīng)時(shí)間、酯化反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)咖啡酸維生素C酯產(chǎn)率的影響。

反應(yīng)物用量對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響見表1。從表1可以看出，隨著丙二酸用量的增加，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率逐漸降低，這是因?yàn)檫^量的丙二酸會(huì)在下一步反應(yīng)中與維生素C發(fā)生酯化生成丙二酸維生素C酯，不利于咖啡酸維生素C酯的生成，使咖啡酸維生素C酯的產(chǎn)率降低，而且導(dǎo)致產(chǎn)物難以分離，目標(biāo)產(chǎn)物純度不高。增加維生素C的用量有利于酯化反應(yīng)進(jìn)行完全，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率也逐漸提高，但是當(dāng)維生素C用量增加到12mmol后，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率增加并不顯著。

表1 反應(yīng)物用量對(duì)咖啡酸維生素C酯產(chǎn)率的影響Table 1 Effect of reactant amount on the yield of caffeic acid vitamin C ester

催化劑用量對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響見表2。結(jié)果表明，增加催化劑的用量有利于縮合和酯化反應(yīng)的進(jìn)行，這是由于隨著催化劑用量的增加，催化劑的活性中心和有效比表面積逐漸增加，從而增加了反應(yīng)物在催化劑表面發(fā)生反應(yīng)的機(jī)會(huì)，使目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率得以提高。當(dāng)催化劑用量大于96mg，可能因?yàn)榇呋瘎┑幕钚蕴撸龠M(jìn)了維生素C和咖啡酸維生素 C酯的氧化，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率反而有所降低。

表2 催化劑用量對(duì)咖啡酸維生素C酯產(chǎn)率的影響Table 2 Effect of catalyst dosage on the yield of caffeic acid vitamin C ester

縮合反應(yīng)時(shí)間對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響見表3。結(jié)果顯示，縮合反應(yīng)在較短的時(shí)間(1h)內(nèi)就可以完成，繼續(xù)延長縮合反應(yīng)時(shí)間，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率無明顯提高。

表3 縮合反應(yīng)時(shí)間對(duì)咖啡酸維生素C酯產(chǎn)率的影響Table 3 Effect of condensation reaction time on the yield of caffeic acid vitamin C ester

酯化反應(yīng)溫度對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響見表4。從表4可以看出，反應(yīng)溫度為60℃，酯化反應(yīng)結(jié)果最好。酯化反應(yīng)溫度過低，酯化反應(yīng)不能進(jìn)行完全，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率較低。酯化反應(yīng)溫度過高，由于維生素C和咖啡酸維生素C酯發(fā)生氧化等副反應(yīng)，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率下降。

表4 酯化反應(yīng)溫度對(duì)咖啡酸維生素C酯產(chǎn)率的影響Table 4 Effect of esterification reaction temperature on the yield of caffeic acid vitamin C ester

酯化反應(yīng)時(shí)間對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響見表5。結(jié)果表明，酯化反應(yīng)時(shí)間過短，酯化反應(yīng)不能進(jìn)行完全，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率較低。反應(yīng)時(shí)間為3h時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率最高。繼續(xù)延長酯化反應(yīng)時(shí)間，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率反而有所下降。

表5 酯化反應(yīng)時(shí)間對(duì)咖啡酸維生素C酯產(chǎn)率的影響Table 5 Effect of esterification reaction time on the yield of caffeic acid vitamin C ester

將反應(yīng)結(jié)束后分離出的催化劑用乙腈洗滌，循環(huán)使用于咖啡酸維生素C酯的合成，結(jié)果見表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SO42－/ZrO2回收處理簡便，重復(fù)使用性能良好，重復(fù)使用6次后，仍具有較高的催化活性。

表6 催化劑的重復(fù)使用結(jié)果Table 6 Results of reuse of catalyst on synthesis of caffeic acid vitamin C ester

2.2 抑菌活性

采用抑菌圈法測定了咖啡酸維生素C酯對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母、青霉、黑曲霉、黃曲霉等7種受試菌的最低抑菌濃度(MIC)和抑制率，結(jié)果見表 7。測試結(jié)果表明，濃度為50mg/m L的咖啡酸維生素C酯對(duì)所有受試菌均有較強(qiáng)的抑制作用，尤其對(duì)細(xì)菌和酵母的抑制作用更高，抑制率達(dá)80%以上。從最低抑菌濃度大小來看，細(xì)菌和酵母對(duì)目標(biāo)化合物也表現(xiàn)出較高的敏感性。

表7 咖啡酸維生素C酯的抑菌活性Table 7 Antibacterial activities of caffeic acid vitamin C ester

2.3 抗氧化活性

DPPH自由基被廣泛用于定量測定生物試樣、酚類物質(zhì)和食品的抗氧化活性，羥基自由基清除率是反映物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)。因此，我們將咖啡酸維生素C酯配制成不同的濃度，測定其對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，并與維生素C的抗氧化性進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果見圖1和圖2。結(jié)果表明，咖啡酸維生素C酯具有優(yōu)良的抗氧化活性，能有效清除DPPH自由基和羥基自由基，清除效果明顯好于對(duì)照樣品維生素C，清除DPPH自由基比清除羥基自由基需要的樣品濃度低。隨著樣品濃度的增加，DPPH自由基和羥基自由基的清除率均明顯增加。當(dāng)咖啡酸維生素C酯濃度為60μmol/L時(shí)，DPPH自由基的清除率已達(dá)88.6%，再增加咖啡酸維生素C酯的濃度，DPPH自由基清除率變化不大。濃度為10mmol/L的咖啡酸維生素C酯對(duì)羥基自由基的清除率為87.5%。

3 結(jié)論

圖1 咖啡酸維生素C酯對(duì)DPPH自由基的清除活性Fig.1 DPPH free radical scavenging activityof caffeic acid vitamin C ester

圖2 咖啡酸維生素C酯對(duì)羥基自由基的清除活性Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging activity of caffeic acid vitamin C ester

以3，4－二羥基苯甲醛、丙二酸和維生素C為原料，SO42－/ZrO2作催化劑，經(jīng)過Knoevenagel縮合和直接酯化一鍋法合成了咖啡酸維生素C酯，實(shí)現(xiàn)了將咖啡酸與維生素C兩個(gè)活性結(jié)構(gòu)單元結(jié)合在一起的目標(biāo)，開創(chuàng)了一種合成新型食品添加劑的新方法。抑菌活性測試結(jié)果顯示，濃度為50mg/m L的咖啡酸維生素C酯對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、釀酒酵母、青霉、黃曲霉、黑曲霉等均具有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率分別為 91.7%、89.2%、81.0%、83.5%、76.3%、52.7%、70.6%，最低抑菌濃度分別為0.776、0.388、0.388、0.194、1.552、12.416、3.104mg/m L。抗氧化性測試結(jié)果表明，咖啡酸維生素C酯可以有效清除DPPH自由基和羥基自由基，清除效果明顯好于對(duì)照樣品維生素C，清除DPPH自由基比清除羥基自由基需要的樣品濃度低。因此，咖啡酸維生素C酯是一種潛在的兼具抑菌活性和抗氧化活性的多功能食品添加劑。

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Synthesis，antibacterial and antioxidant activity of caffeic acid vitam in C ester

LIU Ju－xiang，F(xiàn)AN Guang－pu，LIU Chang－chun*
(School of Biological and Chemical Engineering，Jiangsu Food Science College，Huai’an 223003，China)

A facile one－potmethod for synthesis of caffeic acid vitam in C ester via Knoevenagel condensation and esterification from 3，4－d ihyd roxybenzaldehyde，malonate and vitam in C were stud ied.Antibac terialand antioxidant activity of caffeic acid vitam in C ester were determ ined.In the p resence of SO42－/ZrO2catalyst，caffeic acid was synthesized by Knoevenagel condensation of 3，4－d ihyd roxybenzaldehyde w ith malonate，then esterified w ith vitam in C to give caffeic acid vitam in C ester in 85.1%yield.The struc ture of target com pound was confirm ed by1H NMR and IR spec trum.The antibac terial tests ind icated that caffeic acid vitam in C ester exhib ited good inhib ition activity on Staphylococcus aureus，Escherichia coli，Bacillus sub tilis，Saccharom yces cerevisiae，Penicillium chrysogenum，Asperg illus flavus and Aspergillus niger.And the inhib ition ac tivity of caffeic acid vitam in C ester on bacteria and yeastwere much higher than those on mould.The antioxidant tests indicated that caffeic acid vitam in C ester could efficiently scavenge DPPH free rad ical and hyd roxyl free rad ical，which was significantly higher than that of vitam in C.

caffeic acid vitam in C ester;caffeic acid;vitam in C;antibac terial activity;antioxidant activity

TS202.3

B

1002－0306(2012)19－0218－04

2012－03－27 *通訊聯(lián)系人

劉菊香(1965－)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事食品添加劑的開發(fā)研究。