丁香多酚細胞抗氧化活性的研究

張慧蕓，申云翔，任國艷

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽 471003)

丁香多酚細胞抗氧化活性的研究

張慧蕓，申云翔，任國艷

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽 471003)

目的:研究丁香多酚對由H2O2引起的人肝細胞RBL氧化損傷的保護作用。方法:采用H2O2誘導建立細胞氧化損傷模型，通過測定細胞存活率、細胞抗氧化酶活性、丙二醛等指標，分析探討丁香多酚對細胞損傷的保護作用。結果:結果表明，100μmol/L H2O2孵育24h可顯著誘導RBL細胞損傷，使細胞存活力下降到24.64%，細胞經不同濃度的丁香多酚(0.1、0.5、2、10mg/L)與H2O2共孵育后，特別是10mg/L丁香多酚可使細胞存活率達到59.18%。丁香多酚可通過提高SOD、CAT、GSH－Px酶活性，降低MDA含量，促進受損的RBL細胞修復。結論:丁香多酚對H2O2誘導氧化損傷的RBL細胞具有顯著的保護作用，可作為食源性抗氧化劑。

丁香多酚，抗氧化能力，人肝細胞，過氧化氫，保護作用

隨著自由基和抗氧化劑理論和研究工作的深入，自由基與疾病、衰老的關系及其自由基清除劑、抗氧化劑的研究逐漸成為國內外研究的熱點，然而合成抗氧化劑因為越來越多的被發現有諸多的副作用，高效、低毒的天然抗氧化劑的研究和應用越來越引起人們的重視。植物多酚是一種良好的天然抗氧化劑，其抗氧化功能已經得到廣泛肯定［1］。目前多酚物質生理活性的研究已經成為熱點。已經有許多實驗證明，多酚物質在體內具有良好的抗氧化活性，在心腦血管疾病、抗衰老和抑制腫瘤等方面有明顯的預防和治療效果［2－5］。茶多酚、蘋果多酚和葡萄多酚等植物多酚的體外生物活性已有大量實驗研究［6－9］。丁香為桃金娘科植物丁香(Eugeniacaryophylla Thunb.)的干燥花蕾，是藥食兩用植物。研究表明，丁香具有眾多功能活性［10－12］。Peter等人［13］報道，丁香中的丁香酚、異丁香酚以及沒食子酸等都是重要的抗氧化成分。Chaieb等人［14］提取丁香中的抗氧化物質，進行鑒定得到主要的抗氧化物質為丁子香酚和沒食子酸。目前國內外關于丁香在化學體系中抗氧化活性研究方面已有較多報道［15－20］，但極少涉及對細胞抗氧化活性方面的研究。通過前期研究發現，丁香多酚提取物在體外具有較好的抗氧化和清除自由基活性［21］，為了進一步考察其抗氧化生理功能，本研究主要探討丁香多酚對人肝細胞RBL H2O2損傷后的保護作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丁香 洛陽好一生大藥房;人肝細胞RBL 中國科學院細胞庫;含青霉素和鏈霉素的RPMI－1640培養液 PBS Solarbio公司;0.25%胰酶－EDTA消化液、胎牛血清、DMEM(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium)培養基 Gibco公司;二甲基亞砜(DMSO)溶解后避光保存備用、噻唑藍(3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazoliumbrom ide，MTT) Sigma公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)試劑盒 南京建成生物工程公司。

Model 680酶標儀 BIO－RAD公司;HF－90 CO2培養箱 力康發展有限公司;UV－2401PC紫外分光光度計 日本島津公司;SinChrom ODS－BP柱(250mm×4.6mm) 大連伊利特;D－1320超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 丁香多酚提取物的制備方法 將干燥并碾磨成粉狀的丁香取10g，于250m L三頸瓶中，加入濃度為60%的乙醇100m L，水浴加熱溫度為50℃，攪拌器攪拌，提取時間2h，浸出液10000×g離心15m in，沉淀重新用60%乙醇提取，將第二次的提取液10000×g離心15m in，上清液合并后50℃減壓濃縮至干，取出濃縮液進行真空干燥(40℃、0.07MPa)得到丁香多酚提取物，4℃冰箱保存。測定前將樣品溶于60%乙醇至所需濃度，經0.22μm微孔膜過濾滅菌。

1.2.2 RBL細胞培養與處理 RBL細胞培養基為DMEM，含10%胎牛血清(FBS)、100g/m L雙抗、2mmol/L谷胺酰胺，于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱培養。細胞處于生長對數期時用0.25%的胰蛋白酶消化，接種于96孔細胞培養板，每孔100μL，接種密度2.0×105個/m L，培養24h后分組培養。正常對照組:細胞，不加任何處理;模型組:細胞+100μmol/L H2O2(H2O2單獨處理24h);樣品防護組:細胞+樣品+100μmol/LH2O2(不同濃度的樣品與H2O2同時加入，并共孵24h);樣品對照組:細胞+樣品(樣品單獨處理24h)。

1.2.3 細胞存活率的檢測 細胞存活率檢測:MTT法［22］。96孔板中的細胞分組處理，培養結束后，每孔加20μL(5mg/m L)MTT，培養3.5h后棄上清，每孔加150μL DMSO，充分振蕩溶解紫色結晶，于570nm處用酶標儀檢測各孔OD值。由MTT轉化為不可溶formazan鹽的數量可測定細胞相對存活率。對照組細胞形成formazan的OD相當于100%存活率。處理組細胞存活率結果表示為測定組OD和對照組OD的百分比。

1.2.4 細胞裂解液的制備 細胞裂解液的制備參照Lee等［23］的方法，稍加改動。細胞以1.2×104個/m L密度接種于24孔板。于37℃培養16h后，將不同濃度的樣品(0.1、0.5、2和10mg/L)加入孔板中。于37℃培養24h后，每孔加入150μL細胞裂解液(1% triton X－100)，于4℃裂解12h后測定酶活。細胞裂解液的蛋白質含量由考馬斯亮蘭法測定。酶活表示為U/mg蛋白。

1.2.5 氧化還原酶系及MDA含量的測定 收集各組處理后的細胞培養基及細胞裂解液(細胞收集后經－20℃與室溫下反復凍融三次)。細胞培養液及細胞裂解液的CAT、SOD和GSH－Px水平均按試劑盒說明書進行測定。MDA含量用硫代巴比妥酸(TBARS)方法測定［24］。

1.3 數據分析

每個實驗重復3次，結果表示為平均數±SD。數據統計分析采用 Statistix 8.1(分析軟件，St Paul，MN)利用軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性(p＜0.05)分析使用Tukey HSD程序。

2 結果與分析

2.1 丁香多酚對RBL存活率的影響

圖1為丁香多酚對 H2O2誘導的氧化損傷的RBL細胞存活率的影響，由圖可以看出，與正常對照比，H2O2可顯著誘導RBL細胞損傷，只經H2O2處理的模型對照組使細胞存活率下降到24.64%。隨著丁香多酚添加量的提高，對細胞的保護作用增強，樣品防護組中丁香多酚以0.1、0.5、2mg/L濃度與H2O2共孵時，細胞存活率分別提高了 9.72%、20.84%和27.74%(p＜0.05);當濃度為10mg/L時，細胞存活率從24.64%提高到了59.18%(p＜0.01)。另外，從樣品對照組與正常對照組相比較可以看出，樣品有促進細胞生長的作用，丁香多酚濃度為2mg/L時，細胞存活率提高了10.94%，效果顯著(p＜0.05);丁香多酚濃度為10mg/L時，細胞存活率增加了17.59%，效果非常顯著(p＜0.01)。

圖1 丁香多酚對H2O2誘導的氧化損傷的RBL細胞存活率的影響Fig.1 The effect of clove polyphenols on H2 O2－induced oxidative damage in RBL cells viability

H2O2極易透過細胞膜，可在細胞內通過多種反應而形成高活性自由基，最終對機體造成嚴重損害［25］，因此H2O2已成為研究細胞氧化損傷的重要工具。H2O2對細胞造成不可逆損傷的體現主要是細胞存活率的改變。由于MTT法測細胞存活率方法簡單，實驗周期短，所需細胞數目較少，已成為檢測活細胞和細胞增殖的一個主要手段。本實驗的MTT結果表明，與正常對照相比，丁香多酚在0.1～10mg/L濃度范圍內，均可對細胞起到一定的保護作用。經丁香多酚保護后的細胞存活率提高，且丁香多酚通過抗氧化機制，淬滅氧自由基，減輕了自由基對細胞的損傷，與文獻報道相一致［12］。除此之外，實驗發現一定濃度的丁香多酚具有促進細胞生長的作用。

2.2 丁香多酚對RBL細胞抗氧化酶系的作用

為了研究丁香多酚是否具有提高抗氧化酶系統活力的作用，測定了丁香多酚處理后RBL細胞的CAT、SOD和GSH－Px酶的活力。由圖2可知，正常對照組CAT、SOD和GSH－Px酶的活力均在較高水平，經H2O2處理24h后，模型組的這些指標顯著下降(p＜0.05)，而丁香多酚均可以劑量依賴性的提高其活性。濃度為0.1～10mg/L的丁香多酚作用后的細胞中的三種酶含量均顯著高于損傷對照組(p＜0.05)。

圖2 丁香多酚對氧化損傷的RBL內CAT、SOD和GSH－Px酶活力的影響Fig.2 The effect of clove polyphenols on the activityof CAT、SOD and GSH－Px of injured RBL

機體內存在大量具有清除自由基功能的抗氧化酶系，在抵抗細胞和組織氧化損傷方面發揮著重要的作用［26］，包括SOD、CAT和GSH－Px在內的抗氧化酶可通過攻擊自由基來調節各種疾病的產生。研究表明［27］SOD、GSH－Px、CAT水平是衡量機體及細胞氧化損傷的重要指標。本研究中 H2O2模型組的SOD、CAT和GSH－Px活性下降，而丁香多酚處理后各組的抗氧化酶活性均有所提高，表明丁香多酚可通過抗氧化生理功能，提高細胞抗氧化系統的活性水平，從而減輕了自由基對細胞的損傷。

2.3 丁香多酚對RBL細胞中MDA含量的影響

不同濃度丁香多酚清除MDA的結果見圖3。由圖可以看出，濃度為0.1～10mg/L的丁香多酚對MDA均有明顯的清除作用，隨丁香多酚濃度的增加，MDA含量呈下降趨勢(p＜0.05)，模型組的MDA含量與正常對照組相比顯著升高(p＜0.05)，而樣品防護組中MDA水平比模型組低，并具有統計學意義(p＜0.05)，且10mg/L的樣品防護組水平與正常對照組相當。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發的脂質過氧化作用，形成的脂質過氧化物使組織細胞受損傷，即MDA的含量間接反映細胞的受損程度［28］。從MDA含量變化可以看出，丁香多酚可在一定程度上阻止生物膜的脂質過氧化作用，從而防護了細胞的脂質膜。

圖3 丁香多酚對氧化損傷的RBL內MDA含量的影響Fig.3 The effect of clove polyphenols on the MDA content of injured RBL

3 結論

丁香多酚可在適宜濃度下對由H2O2誘導引起的RBL細胞氧化損傷起到保護作用，并且可以劑量依賴性地顯著提高細胞中抗氧化酶SOD、GSH－Px和CAT的活性，降低MDA含量，同時促進RBL細胞生長。因而丁香多酚具有潛在的生理功能和廣闊的應用前景。

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Study on the antioxidant capacity of clove polyphenols in cell

ZHANG Hui－yun，SHEN Yun－xiang，REN Guo－yan
(College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China)

Ob jective:A study was conducted to investigate the p rotective effects of c love polyphenols extracts on RBL caused by the damage of H2O2and its p rotective mechanism.Method:Oxidative damage was induced by H2O2，and cell viab ility was m easured by the MTT assay.The influence of c love polyphenols extrac ts on H2O2induced RBL injury was assessed by measuring the superoxide d ismutase(SOD)，catalase(CAT)，and g lutathione peroxidase(GSH－Px)ac tivities and the malond ialdehyde(MDA)content.Result:The results demonstrated that RBL cells were damaged by incubation w ith 100μm ol/L H2O2for 24h，and the viability of RBL cells reduced to 24.64%.The add ition of c love polyphenols extrac ts(0.1，0.5，2 and 10m g/L)into the RBL cell suspensions p rior to the exposure to 100μmol/L of H2O2resulted in a greater survival rate of the cells.In particular，the cell viability reached 59.18%after treating w ith 10mg/L c love polyphenols extrac ts.Moreover，at elevated concentrations，c love polyphenols extrac ts exhibited inc reased repairing capability for injured RBL as well as inc reased p rotec tion of SOD，CAT and GSH－PX while reduced MDA formation.Conc lusion:The c love polyphenols extrac ts possessed p rotec tive effec ts on RBL cell injuries induced by H2O2，and this may be related to the antioxidative activity of c love polyphenols.

c love polyphenols;antioxidant capacity;RBL;H2O2;p rotec tion

TS201.2

A

1002－0306(2012)19－0147－04

2012－03－20

張慧蕓(1977－)，女，博士，副教授，研究方向:畜產品加工。