牡蠣酶解產物改善小鼠學習記憶能力的初步研究

林海生，曹文紅，盧虹玉，章超樺，呂妙兄，席 慶

(廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東湛江 524088)

牡蠣酶解產物改善小鼠學習記憶能力的初步研究

林海生，曹文紅，盧虹玉，章超樺*，呂妙兄，席 慶

(廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東湛江 524088)

探討了牡蠣酶解產物對小鼠空間學習記憶能力的影響。選用中性蛋白酶、動物蛋白酶和復合酶分別水解牡蠣蛋白得到EHO1、EHO2和EHO3，分析其基本營養成分和分子量分布;采用Morris水迷宮行為學方法考察EHO對小鼠學習記憶的改善能力。結果顯示，EHO含有豐富的肽、糖原、?；撬?，分子量在主要集中在1300～10000u之間;定位航行測試顯示，相對于空白組，EHO干預后小鼠的潛伏期都明顯的縮短，空間搜索策略的比例明顯提高，EHO3組效果最好，潛伏期(16.77±7.74)s(p＜0.05)，空間搜索的比例為85.71%;而空間探索實驗中，給藥組小鼠的穿越次數、中央活動時間和目標象限路程比都有不同程度的增加。實驗結果表明一定劑量的EHO能夠提高小鼠的空間學習和記憶能力。

牡蠣酶解物，Morris水迷宮，學習記憶

近江牡蠣(Ostrea rivularis)又名海蠣子、蠔等，廣泛分布在我國南北沿海，是我國主要經濟貝之一。廣東沿海對近江牡蠣的養殖歷史悠久，資源十分豐富。牡蠣含有豐富的蛋白質、氨基酸、糖原和微量元素等，營養價值極高，具有廣泛的生理活性，素有“海洋牛奶”“根之源”之美名，已被我國衛生部批準為第一批既是藥材又可作為食品保健品［1］。目前，國內牡蠣以鮮食為主，牡蠣加工比例僅占10%左右，加工品中以制成干肉制品為主，少量加工成蠔油或其它調味品［2］。隨著牡蠣養殖業的快速發展，近江牡蠣的產量迅速增加，資源高值化利用及其深加工技術應用對于牡蠣產業的發展具有重要的意義。近些年研究發現牡蠣具有如抗癌、抗病毒、抗疲勞、抗氧化、降血糖、降血壓、降血脂、醒酒護肝等多種生物活性［3］。學習和記憶是大腦高級神經功能之一，隨著環境惡化和人口老齡化進程，導致學習記憶、認知功能衰退等中樞神經系統退行性疾病發病率逐年升高，如老年癡呆癥 (Alzheimer’s disease，AD)、帕金森癥(Parkinson’s disease，PD)等，其影響因子主要有神經肽及其他神經遞質［4］。由于其發病成因多、機制復雜，單純的西藥治療所取得的效果仍不盡人意，因而開發天然營養保健食品成為防治該類疾病的重要途徑。目前已有報道?；撬幔?］、微量元素［6］、中藥活性成分［7］、豬腦水解物［8］、β－乳球蛋白肽［9］等物質具有改善增強記憶功能、延緩衰老和防治阿爾茨海默氏病的功能。本研究利用生物酶法制備牡蠣酶解物，采用Morris水迷宮實驗考察牡蠣酶解物對小鼠空間學習和記憶功能的影響，為進一步深入研究牡蠣中增強學習記憶能力的活性成分及功能因子奠定前期基礎，亦為開發相關保健食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣 購自廣東省湛江市東風市場，經廣東海洋大學蔡英亞教授鑒定為近江牡蠣 (Ostrea rivularis);昆明種小鼠 體重18～22g，雌雄對半，廣東醫學院實驗動物中心提供，合格證書SYXK(粵)。

Morris水迷宮動物行為學分析系統 淮北生物儀器設備有限公司;HHS電熱恒溫水浴鍋 上海躍進醫療器械廠;FJ－200組織勻漿器 上海標本模型廠;FDu－1100冷凍干燥機 TOKYO RIKAKIKAI; GL－10LMD高速冷凍離心機 湖南星科科學儀器有限公司;AUW 120分析天平 日本 SHIMADZU; LC－20AT型LPLC分析柱為蛋白凝膠柱PROTEINPAK 60(WAT085250) 日本島津;LC－20AD型HPLC分析柱 hypersil ODS C18(120mm×4.0mm，5μm) 日本島津;中性蛋白酶(20萬μ/g)、木瓜蛋白酶(20萬μ/g)、動物蛋白水解酶(20萬μ/g) 廣西龐博生物科技有限公司;其他試劑 分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣酶解產物的制備［1］工藝如下:新鮮牡蠣→清洗瀝干→稱重加水(m/V=1∶1)→組織均漿→酶解→滅酶(100℃，10min)→離心(6000r/min，15min)→上清液(測定水解度)→低溫真空濃縮→冷凍干燥→淺黃色干粉，即牡蠣酶解產物(Enzymatic Hydrolysis of Oyster，以下簡稱EHO)。

酶解條件:pH7.0，時間3.0h，水解溫度55℃，酶和底物比(E/S)2%，選用中性蛋白酶、動物蛋白酶、復合酶(中性蛋白酶、動物蛋白酶和木瓜蛋白酶的質量比為1∶1∶1)對牡蠣進行水解分別得到EHO1(中性蛋白酶酶解物)、EHO2(動物蛋白酶酶解物)和EHO3(復合酶酶解物)。

1.2.2 水解度的測定［10］總氮測定:凱氏定氮法; α－氨基態氮含量測定:甲醛滴定法。

水解度 DH(%)=(水解液中 α－氨基氮含量－水解前α－氨基氮含量)/(原料總氮含量－水解前α－氨基氮)×100

1.2.3 基本成分測定 水分測定:GB5009.3－2010直接干燥法;粗脂肪測定:GB5009.6－2003索氏抽提法;粗蛋白測定:GB5009.5－2010凱氏定氮法測定總氮含量再乘以6.25;灰分測定:GB5009.4－2010;總糖測定:硫酸苯酚法;總肽含量測定:雙縮脲法［11］;?；撬岷繙y定:OPA柱前衍生高效液相色譜法［12］。

1.2.4 分子量分布測定 高效體積排阻色譜(HPSEC)法［13］。

1.2.5 動物分組及飼養 小鼠共40只，適養3d后稱重，采用隨機數字表法將其分成4組:EHO1組、EHO2組、EHO3組和空白組，按照相同灌胃劑量5g/(kg·d)分別灌以 EHO1、EHO2、EHO3和蒸餾水［1］。EHO分別配制成一定濃度的水溶液，每10g小鼠體重灌0.2m L。每天上午9:00～10:00灌胃一次，連續30d后進行Morris水迷宮定位航行實驗，期間小鼠自由進食基礎鼠糧及飲水。

1.2.6 Morris水迷宮實驗［14－15］定位航行:Morris水迷宮為一直徑1.2m、高0.5m圓桶，劃為四個象限，有一直徑10cm平臺固定于某一象限，控制水的高度剛好沒過平臺，水溫控制25℃。實驗在當天灌胃30m in后進行，連續訓練5d。先將小鼠放于水中平臺30s熟悉周圍環境，再分別將其從四個象限面向池壁放入水中，搜索時間設定為90s，其運動軌跡自動錄像記錄于電腦中，由MWM視頻分析軟件分析得出小鼠的游泳路徑、找到站臺時間(潛伏期:s)、平均游泳速度及搜索策略。

空間探索:用于測量動物對平臺的空間位置的記憶能力。第6d撤掉平臺，在相同入水點(離平臺最遠的象限)將鼠放入水中，搜索時間為90s，電腦錄像自動記錄小鼠的運動軌跡，通過MWM視頻分析軟件計算出各組小鼠的穿越平臺次數、游泳總路程、中央活動時間和目標象限的路程比，綜合評價小鼠記憶保持能力。

2 結果與討論

2.1 EHO基本成分及分子量分布

中性蛋白酶、動物蛋白酶和復合酶酶解牡蠣蛋白的水解度(%)分別為14.95% ±0.80%、21.49% ± 2.73%和29.64%±3.32%。酶的水解能力具有專一性，不同的酶水解蛋白質的肽鍵不同。多酶復合可以增加酶對蛋白質分子的酶切位點，釋放出更多的肽片段及游離氨基酸，從而提高蛋白的水解能力。高翔等［16］在酶解利用龍蝦副產物中蛋白的研究中發現復合酶解效果優于單酶，不僅產品的水解效率提高，而且改善風味，減低苦味。在本研究中選用的動物蛋白酶屬于多酶系，因此其水解度也大于中性蛋白酶。

基本成分測試結果顯示(表1)，EHO的主要成分為蛋白質(肽)、糖原。三種牡蠣酶解物中粗蛋白含量接近，約占70%，但其中水溶性總肽含量卻有所差別，EHO1＞EHO3＞EHO2;總糖和粗脂肪含量相差不遠，分別約占14%和5%。同時含有豐富的?；撬幔f明EHO具有很高營養價值和保健功能。

以分子量標準物質的保留時間(t)為橫坐標，分子量的對數 LgMW 為縱坐標作圖，得回歸方程: LgMW=6.4972－0.2261 t，相關系數R=0.9877。圖1為牡蠣蛋白酶解物EHO1、EHO2和EHO3的HPLC圖，從圖中可以看出，三個樣品均含有5個主峰，但是相對于EHO1樣品(tA=8.08m in)，EHO2和EHO3樣品A峰(tA分別為8.55m in和8.58m in)較小且發生后移，其余4個峰的基本一致，可判斷 EHO2和EHO3的水解程度較大，分子量相對較大的肽類物質比EHO1少。這結果與朱國萍等［13］在研究蝦頭自溶過程中發現隨著水解度增大，酶解物的峰形不斷向后推移的報道相一致，也與前面測得的總肽含量數據相吻合。根據回歸方程計算出各峰處對應的相對分子質量，結果顯示，EHO1、EHO2和EHO3的分子量分別集中于206～46807、200～36648、206～36042u之間，其中分子量在1300～10000u左右的低分子肽分別占57.76%、58.29%和61.83%。

表1 EHO主要營養成分含量(干粉)Table 1 Contents of themajor components in EHO

圖1 EHO的分子量分布圖Fig.1 Themolecular weight distribution of EHO

2.2 EHO改善小鼠空間學習記憶的功能

2.2.1 Morris定位航行 經過4d訓練，小鼠尋找站臺的時間明顯縮短，說明重復性MWM訓練可以提高小鼠的空間學習能力。最后一次定位航行實驗結果顯示，EHO1組和EHO3組小鼠的潛伏期(分別為(17.82±9.43)、(16.77±7.74)s)顯著低于空白組(p＜0.05)，而EHO2組的潛伏期(20.85±3.77)s雖低于空白組，但沒有顯著差異(p＞0.05)，如圖2所示。同時，相對于空白組，EHO3組小鼠的游泳速度顯著降低(p＜0.01)，而EHO1和EHO2組則沒有顯著差異(p＞0.05)(圖2)。潛伏期是衡量小鼠空間學習能力強弱的重要指標之一，而游泳速度是小鼠運動能力的重要指標，實驗結果顯示EHO3組小鼠學習能力與游泳速度有一定的相關性，這可能與小鼠的情緒和應激性有關，但游泳速度不能作為學習記憶能力強弱的直接指標［17］。

搜索策略是衡量動物分析判斷能力和解決問題能力的重要指標，典型的四種搜索策略如圖3所示(ABCD圖)。學習和記憶過程中，小鼠的搜索策略隨著訓練次數的增加而呈現“邊緣式→隨機式→趨向式→直線式”的變化規律，學習記憶能力好的小鼠，其搜索策略以空間策略(趨向式和直線式)為主，相反則以邊緣式和隨機式為主［18］。搜索策略分析結果顯示(圖4)，與空白組相比，在EHO干預下的小鼠采用空間策略的比例均明顯提高。其中以EHO3組最為明顯，空間策略的比例占85.71%，而空白對照組僅占59%。采用直線式搜索策略比例最高亦為EHO3組，約占30%。

圖2 定位航行實驗中EHO對潛伏期和游泳速度的影響Fig.2 Effect of EHO on the escape latency and the swimming speed in navigation test

綜上，在定位航行實驗中，相對于空白組，EHO1組、EHO2組和EHO3組小鼠的潛伏期均有明顯的縮短，而采取空間搜索的比例都有明顯提高，其中EHO3組效果最好，潛伏期為(16.77±7.74)s，游泳速度為(14.61±3.71)cm/s，空間搜索的比例為85.71%。結果表明，EHO能夠提高小鼠空間學習能力。

圖3 典型的搜索策略和目標探索游泳路徑圖Fig.3 Representative pictures of the swimming trails in MWM

表2 EHO對小鼠空間記憶保持能力的影響Table 2 Effect of EHO on the ability of spatialmemory

圖4 定位航行實驗中小鼠空間搜索策略的分布Fig.4 Distribution of search strategies ofmice in place navigation test

2.2.2 Morris空間探索 空間探索測試結果顯示: EHO1組、EHO2組和EHO3組小鼠穿越平臺次數均高于空白組，相反，其游泳經過的總路程卻均有所縮短，但沒有顯著性差異(p＞0.05);與空白組相比，EHO1組、EHO2組和EHO3組小鼠在中央活動時間均有顯著性增加(p＜0.05)，EHO2組的時間最長為(61.04±3.44)s(p＜0.05);同時EHO2組的目標象限路程比為(28.192±2.99)%(p＜0.05)，顯著高于空白組，而EHO1組和EHO3組該指標沒有顯著性差異(p＞0.05)(表2)。EHO2和空白組的游泳路徑如圖4(E圖和F圖)。

小鼠穿越平臺次數是衡量小鼠對平臺空間位置學習記憶能力的重要指標［19］。任建華等［20］評價小米和大豆為基料的嬰幼兒輔食改善小鼠記憶作用采用穿越平臺次數做指標。而王維剛等人［21］在研究MWM實驗方法中結合游泳總路程、中央活動時間、目標象限路程比等其他指標進行綜合評價。從表2數據看出，EHO干預后小鼠的穿越平臺次數、中央活動時間及目標象限路程比有不同程度的升高，行為學指標表明EHO能夠提高小鼠空間學習記憶的保持能力，其中以EHO2組效果最好。

綜上所述，EHO能夠提高實驗小鼠的空間學習和記憶能力。

3 結論

牡蠣具有豐富營養價值和廣泛的生物活性，利用酶解技術是牡蠣資源精深加工的重要途徑。牡蠣蛋白酶解物含有豐富的營養物質和活性因子，如肽、糖原、牛磺酸等，分子量在主要集中在1300～10000u之間。Morris水迷宮實驗結果顯示，相對于空白組，EHO干預后小鼠的潛伏期均有明顯的縮短，而采取空間搜索的比例都有明顯提高，其中EHO3組最為顯著，潛伏期為(16.77±7.74)s(p＜0.05)，空間搜索的比例為85.71%;而空間探索實驗中，給藥組小鼠的穿越次數、中央活動時間和目標象限時間比都有所增加，以EHO2組效果最好，穿越次數3.14±0.9，中央活動時間為(61.04±3.44)s(p＜0.05)，目標象限路程比為(28.19±2.99)%(p＜0.05)。實驗結果表明一定劑量的EHO能夠提高小鼠的空間學習和記憶能力。由于酶解產物成分較復雜，其改善小鼠空間學習記憶功能的主要因子和作用機理有待于進一步研究。

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Prelim inary research on the function of enzymatic hydrolysis of oyster to im prove the learning and memory in m ice

LIN Hai－sheng，CAO W en－hong，LU Hong－yu，ZHANG Chao－hua*，LV M iao－xiong，XIQing
(Food Science and Technology Institute of Guangdong Ocean University，Key Laboratory of Aquatic Product Advanced Processing of Guangdong Higher Education Institutes，Zhanjiang 524088，China)

Investigation of the effec t of enzymatic hyd rolysis of oyster(EHO)on learning and memory ab ility.The contents ofmajor components and the molecular weight distribution of the EHO p repared respectively by adding neutrase，p roteolytic enzymes and m ixed enzymes were test，then the learning and memory ability were assessed using the Morris watermaze(MWM)w ith one controlgroup.The results showed that the EHO was rich in pep tide，glycogen and taurine，and the molecularweights were from 1300～10000u.MWM test indicated that the p roportion of spatial strategy of the treated g roups were higher and the escape latency were significantly shorter com pared to the control g roup.EHO3 group was the best one，the escape latency was(16.77±7.74)s(p＜0.05)and the p roportion of spatialstrategy reached 85.71%.All the three EHO g roups had more number of c rossings，longer time in the center and longer d istance in the target quad rant than that of control g roup in the spatial p robe test.These find ings suggested that certain amount of EHO could im p rove the learning and mem ory ab ility ofm ice.

enzym atic hyd rolysis of oyster;Morris waterm aze;learning and memory

TS218

A

1002－0306(2012)19－0341－05

2012－02－27 *通訊聯系人

林海生(1985－)，男，在讀研究生，研究方向:海洋生物資源利用。

國家現代農業產業技術體系(CARS－48)。