基于Gluconobacter oxydans膜結合脫氫酶的靜息細胞催化合成2-酮基-D- 葡萄糖酸

陳鴻勝，李克非，舒行宙，劉 瀏，林金萍，魏東芝

(華東理工大學，生物反應器國家重點實驗室，魯華生物技術研究所，上海 200237)

基于Gluconobacter oxydans膜結合脫氫酶的靜息細胞催化合成2-酮基-D- 葡萄糖酸

陳鴻勝，李克非，舒行宙，劉 瀏，林金萍*，魏東芝

(華東理工大學，生物反應器國家重點實驗室，魯華生物技術研究所，上海 200237)

基于G.oxydans DSM2003膜結合葡萄糖酸－2－脫氫酶(GA－2－DH)的催化特性，利用靜息細胞催化技術合成D－異抗壞血酸(EA)的主要前體2－酮基－D－葡萄糖酸(2－KGA)。利用高濃度底物自適應篩選技術，篩選到高產2－KGA菌株并對其搖瓶催化進行優化，優化后最適條件為:溫度30℃，pH6.0，細胞濃度20g/L，底物濃度1100mmol/L，搖床轉速250r/min，此時時空產率為24.68mmol/L/h;搖瓶優化工藝基礎上在7L發酵罐中對重點影響參數(轉速與底物濃度)進行了進一步優化，優化后2－KGA的時空產率提高到74mmol/L/h，并且催化細胞可有效重復利用3次。

2－KGA，氧化葡萄糖酸桿菌，靜息細胞催化，工藝優化

氧化葡萄糖酸桿菌具有豐富的膜結合與胞內氧化系統、不完整的TCA循環以及缺失的糖酵解途徑，使其能夠將多種糖、醇以及醛類物質不完全氧化合成相應的產物［1］。而其基于結合酶的反應更是具有反應快分離容易等特點而被廣泛應用于食品以及化工品合成等行業，如(R)－β－羥基異丁酸［2］合成等。2－酮基－D－葡萄糖酸(2－KGA)是目前大規模生產的一種有機酸，被廣泛應用于合成D－異抗壞血酸(鈉) (EA/EN);EA作為肉類、水果、飲料等食品中可代謝抗氧化劑可以有效地減少食品的氧化，防止其色、香、味褪變，抑制食品中致癌物質亞硝酸鹽的生成，其防腐效果大大超過維生素C，而價格不到維生素C的二分之一，有很好的應用前景［3－4］。另外，2－KGA還可以用來合成有機糖(酸)及其衍生物，如樹膠醛醣、核酮糖、羥基丙二酸［5］、醛基糖酸［6］以及氨基糖［7］等;可以作為顯影劑、動物飼料添加劑、除草添加劑［8］以及建筑水泥行業增塑劑［9］。目前，2－KGA的合成方法主要有 3種:化學合成法［10］、酶法［11］和發酵法［12］，其中以熒光假單胞桿菌發酵法為實際生產中最主要的合成工藝［3］，過程中時空產率高達6.22g/L/h(32mmol/L/h)，平均發酵轉化率為89%［13］。本文根據G.oxydans具有的膜結合葡萄糖酸－2－脫氫酶(GA－2－DH)可氧化葡萄糖酸(GA)生成2－KGA的特性，建立了靜息細胞催化法合成2－KGA的工藝。主要考察了影響催化效率的關鍵因素，并進行了重復利用靜息細胞多批次轉化合成2－KGA的研究，為2－KGA的生物合成開拓了一條新的潛在生產途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2－KGA、5－KGA Sigma－A ldrich;葡萄糖酸鈉(GA) 上海卡博工貿有限公司;G.oxydans#3 (DSM2003)及其篩選菌株G.oxydans#3A 均由華東理工大學生物反應器國家重點實驗室保藏。

恒溫培養搖床 上海Shenergy Biocolor公司;恒溫轉化搖床 上海華利達實驗儀器有限公司;7L發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司;高效液相色譜檢測系統 美國安捷倫公司。

1.2 菌株培養與篩選

1.2.1 培養基成分 液體山梨醇培養基:8%山梨醇，2%酵母粉，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.01%L－Glutamine;液體 GA培養基:10%～30% GA，1%葡萄糖，2%酵母粉，0.1%KH2PO4，0.05% MgSO4·7H2O，0.01%L－Glutam ine;在液體培養基加入1.5%瓊脂即得固體培養基。

1.2.2 細胞培養及自適應篩選 將菌從甘油管或者平板培養基上移接至液體培養基進行一級種子培養24h，接著以10%接種量接至下級培養基中，于30℃(發酵罐pH控制在5.8～6.0)條件下培養22h。高濃度GA液體(固體)培養基培養菌體，使其通過自適應的方式得到篩選。

1.3 搖瓶小型轉化及發酵罐放大

菌體培養液離心得到靜息細胞，稱取一定量該菌體細胞加入至裝有20m L GA底物溶液的150m L三角瓶中，pH調至實驗值，置于30℃的恒溫搖床中反應。放大實驗在7L發酵罐中進行，反應基本條件為30℃，pH5.0。

1.4 檢測方法

利用 ICE－COREGEL 87H3高效液相色譜柱(Transgenom ic，Inc.)進行檢測，檢測條件為:流動相為0.008N的硫酸溶液、流速0.6m L/m in、柱溫35℃、進樣量10μL，GA、2－KGA、5－KGA能夠得到有效地分離，保留時間分別為8.6、7.8、8.2m in。

1.5 最終轉化率的計算

2 結果與分析

醋酸桿菌科(特別是氧化葡萄糖酸桿菌屬)微生物能通過膜結合脫氫酶GA－2－DH與GA－5－DH將GA分別氧化成2－KGA和5－KGA，但不同的菌株以及培養基條件，產生2－KGA與5－KGA的量有所不同［14］。本實驗以實驗室保藏的一株G.oxydans#3為出發菌株，以GA為底物，分別通過發酵法和靜息細胞催化法合成2－KGA，結果發現發酵體系中同時產生了2－KGA和5－KGA，但以2－KGA為主;而在靜息細胞催化GA的過程中，卻只檢測到2－KGA的產生，沒有5－KGA產生，實現了產物的100%選擇性合成，因此本研究確定了靜息細胞催化法合成2－KGA的工藝。

2.1 高產2－KGA菌株的篩選

為了篩選耐高濃度GA并高產2－KGA的菌株，實驗中首先將出發菌株G.oxydans#3在含有不同濃度梯度GA的培養基中培養，利用其對生長環境的自適應進化，提高菌株的底物耐受性，并誘導其目的酶的過表達，從而獲得了一株2－KGA產率明顯提高的進化菌株G.oxydans#3A。圖1和圖2分別顯示了原始菌與進化菌的生長情況和催化合成2－KGA的比較。從圖1可以看出，G.oxydans#3A的生長趨勢與G.oxydans#3基本相似，在20h時取樣檢測發現前者的菌體得率(單位體積培養液菌體量)為10.7g/L略高于后者的10g/L。而從圖2中可以發現，G.oxydans #3A在48h就能將440mmol/LGA完全消耗，而原始菌則需要60～72h，這表明在高濃度GA的自適應過程中，負責合成2－KGA的關鍵酶GA－2－DH的表達水平或者活性可能得到提高，從而在催化GA合成2－KGA的過程中表現出更高的轉化效率。

圖1 原始菌與進化菌的生長曲線比較Fig.1 Growth curves of initial strain and improved atrain

圖2 原始菌與進化菌催化合成2－KGA活力比較Fig.2 Comparison of 2－KGA productivity of G.oxydans#3 and G.oxydans#3A

2.2 細胞菌體培養時間與細胞活性的關系

細胞中酶的表達通常受到菌體生長周期的影響，因此細胞的收集時間可能對其催化活性很關鍵。實驗中在菌體生長的不同時間點取出20～50m L培養液，離心后獲取靜息細胞，測定其合成2－KGA的初速度(即前5h的平均速度)結果如圖3所示。在菌體培養初期3h與6h(延遲期到對數期初期)，細胞催化GA合成2－KGA的能力相對較弱，其催化初速度在9.0～10mmol/L/h;隨著菌體的快速增殖，靜息細胞的催化活性顯著提高，生長到12h時細胞的催化活性達到最高值15.5mmol/L/h，之后獲取得到的靜息細胞的催化活性基本維持不變，而進入衰亡期的細胞的催化活性會有微弱的下降。關聯圖1可以發現，對數生長期的細胞表現最高的GA催化活性，因此為了能在具有最高細胞催化活性的同時獲得盡可能多靜息細胞，實驗選擇培養21～22h(細胞對數生長期末)獲得的靜息細胞作為催化劑來催化合成2－KGA。

2.3 搖瓶中催化合成2－KGA的條件優化

2.3.1 溫度對靜息細胞催化活性的影響 靜息細胞催化過程中，體系的溫度會通過酶活以及底物與溶氧的傳質來影響合成2－KGA的效果。氧化葡萄糖酸桿菌中GA－2－DH最適溫度與其他大多數的膜結合酶相似，在30℃左右［15］，當然也有某些特殊的氧化葡萄糖酸桿菌菌株溫度可達37℃，甚至更高［16］。所以實驗中對不同溫度進行了考察，結果如表1所示，可以發現靜息細胞催化過程控溫在30℃，細胞有較好的轉化效果。

表1 不同溫度對靜息細胞催化合成2－KGA的影響Table 1 The effect of temperature on the 2－KGA production by resting cells

表2 不同pH對靜息細胞催化合成2－KGA的影響Table 2 The effect of pH on the 2－KGA production by resting cells

表3 不同靜息細胞濃度對催化合成2－KGA的影響Table 3 The effect of concentration of resting cells on the 2－KGA production

圖3 培養時間對靜息細胞催化活性的影響Fig.3 The effect of incubation time on the activity of resting cells

2.3.2 pH對靜息細胞催化活性的影響 文獻報道，G.oxydans中的酶GA－2－DH通常在酸性環境下表現較好的活性;對于某些氧化葡萄糖酸桿菌在催化GA或葡萄糖時，生成2－KGA與5－KGA比例也受pH的影響［14］。因此實驗考察了不同 pH的反應體系中2－KGA的生成情況，結果如表2所示。

不同pH條件下G.oxydans#3A催化GA合成2－KGA的效率差異較為明顯，pH4.5～6.0之間，GA的轉化效率和2－KGA的產量最高，而在pH5.0時產物的時空產率最高。反應體系的pH低于4.0或高于6.0，都不利于催化反應的進行。實驗所得到最適pH與Ano以及Shinagawa等人所報道的GA－2－DH最適pH較為相似［17］。

2.3.3 細胞濃度對靜息細胞催化活性的影響 實驗在底物GA濃度1100mmol/L(242g/L)條件下對細胞濃度進行優化。從表3看出反應體系中菌體含量在10g/L增至15g/L時，反應的速度也隨著增大，但是當細胞繼續增加至30g/L時，細胞合成2－KGA的效果反而變差，這可能由于:細胞過多造成底物傳質利用效率的變差;氧傳質變差以及過多細胞需要大量的氧，造成局部缺氧甚至菌體自溶，這嚴重影響催化效率以及自溶引起的胞內物釋放造成下游分離壓力加大。因此，實驗選擇20g/L作為最優的菌體濃度。

2.3.4 底物濃度對靜息細胞催化活性的影響 反應體系中底物濃度過高可能會引起底物抑制，減慢底物的利用速率，而且可能由于一定時間內底物不能被完全轉化成產物，從而以“副產物”形式存在于催化終體系中，造成資源浪費和下游分離難度加大，特別是對GA與2－KGA這樣分離較為困難的反應，因此一個較為理想的底物濃度對于催化的高效性與實效性有著一定的意義。表4可以看出搖瓶催化體系中底物濃度為1100mmol/L時，催化效果相對較優。另外，通過流式細胞檢測技術(檢測圖譜未給出)對各個底物濃度條件下催化36h后的菌體形態進行檢測，可以發現隨著體系中底物濃度的增大，靜息細胞受到的損傷越大，細胞形態維持越差。

2.3.5 搖床轉速對于靜息細胞催化活性的影響 氧化葡萄糖酸桿菌是一類嚴格好氧微生物，溶氧對催化反應非常關鍵，這主要是由于GA氧化合成2－KGA時脫下的［H］的受體是氧，反應體系中溶解氧濃度決定了反應的速率與底物的投料量。在搖瓶催化體系中，溶氧很大部分受到搖床轉速的影響，因此實驗中對搖床轉速進行了考察，從表5可以看出，適當的提高搖床轉速可增加2－KGA的時空產率。但當轉速提高到300 r/m in時，由于轉速太快體系中形成明顯漩渦狀，甚至反應液會被甩出反應瓶，反而不利于溶氧與傳質，反應效果變差。

表4 不同底物GA濃度對催化合成2－KGA的影響Table 4 The effect of GA concentration on the 2－KGA production by resting cells

表5 不同搖床轉速對催化合成2－KGA的影響Table 5 The effect of rotation speed on the 2－KGA production by resting cells

因此，通過上述搖瓶中的單因素考察，在30℃、pH5.0、細胞濃度20g/L、底物濃度1100mmol/L、搖床轉速250r/min的優化條件下，催化過程最大時空產率達到31.63mmol/L/h，平均時空產率為24.68mmol/L/h，轉化率在97%以上。

2.4 7L反應器上規模放大以及工藝優化

搖瓶實驗存在傳質以及溶氧供應方面的劣勢，其轉化效率相對較低，為了更好的研究以及提高G.oxydans#3A對于催化GA合成2－KGA的能力，實驗在7L發酵罐中對影響催化效果的關鍵因素(溶氧、底物濃度)進行了進一步優化，結果如圖4與圖5所示。

圖4 發酵罐攪拌速度對合成2－KGA的影響Fig.4 The effect of stirring speed on the prodution in the fermentor

圖5 發酵罐中不同底物濃度對合成2－KGA的影響Fig.5 The effect of concentration of GA on 2－KGA the 2－KGA prodution in the fermentor

在轉速考察過程中，由于合成2－KGA反應需氧量很大，實驗中將通氣開到最大值8L/min。從圖4可以看出隨著轉速的提高，催化效果顯著改善，在650 r/m in轉速條件下，14±1h內G.oxydans#3A靜息細胞基本將1100mmol/L的GA完全轉化為2－KGA，時空轉化率達73mmol/L/h，而相同細胞量搖瓶催化則需要44h;而當轉速繼續提高，溶氧并沒有進一步上升，而催化效果也沒有進一步提高，反而在攪拌體系中央容易形成真空圈，機械剪切對細胞的損傷也變大，不利于細胞的重復利用，因此在7L發酵罐中，初步確定較理想的攪拌速度為650 r/m in。

由于溶氧以及傳質的改善，實驗對底物也進行了進一步優化，根據化學反應過程的動力學原理可知r［P］=k×C［S1］×C［S2］，底物濃度越大產物合成的速率越快。但由圖5可以看出，本實驗中葡萄糖濃度在1375～1835mmol/L時，合成2－KGA的速率隨著底物濃度的提高反而減小，這主要是由于底物濃度不合適地增大造成溶氧情況與底物傳質相對低濃度較差，而且在高密度、高滲透壓與高粘度的溶液中，靜息細胞菌體在高速攪拌下容易破碎失活，在1835mmol/L濃度條件下表現最為明顯，經過48h催化后的細胞顏色變成褐紅色，離心后的菌體變成絮團狀，因此將較優濃度設為1375mmol/L。

2.5 G.oxydans#3A靜息細胞在7L發酵罐上的重復利用

在 30℃、pH5.0、細胞濃度 20g/L、底物濃度1375mmol/L、攪拌速度 650 r/m in條件下進行G.oxydans轉化實驗，每次轉化反應結束(當溶氧開始急速上升時)，離心收集細胞進行下一輪催化反應。根據圖6顯示，反應在前3批中均顯示很好的重復性，催化活性能保持在上一批95%以上，但是在進行到第4批時，由于靜息細胞長時間暴露在高滲透環境以及較高機械剪切的情況下，導致細胞破裂加劇，離心得到的細胞僅為第三批的80%左右，反應體系氣泡異常嚴重影響溶氧，細胞的催化活性開始顯著下降，因此目前反應有效批次為3批，2－KGA時空產率達到67.5～74.0mmol/L/h。

圖6 7L發酵罐上靜息細胞催化GA合成2－KGA的批次研究Fig.6 The repeated utilization of resting cells to produce 2－KGA from GA in 7L fermentor

3 結論

本實驗已篩選得到的一株高產2－KGA的菌株G.oxydans#3A，建立了靜息細胞催化法合成2－KGA的工藝路線。在30℃，pH5.0，細胞濃度20g/L，底物濃度1365mmol/L條件下，底物轉化率在97%以上，2－KGA時空產率高達74mmol/L/h，細胞能夠有效重復利用3次。這一路線是2－KGA的生物合成中發酵法之外的另一條高濃度合成2－KGA的高效工藝路線，而且可以一定意義上解決目前發酵法中存在的主要問題:a.噬菌體污染問題沒有從根本上得到解決;b.發酵體系中含有各種復雜的細胞分泌物，大大增加了下游產品分離、純化與結晶的工藝。

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High－yield production of 2－keto－D－gluconate by resting cells of G luconobacter oxydans

CHEN Hong－sheng，LIKe－fei，SHU Xing－zhou，LIU Liu，LIN Jin－ping*，WEIDong－zhi
(New World Biotechnology Institute，State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science＆Technology，Shanghai200237，China)

Resting cells of G.oxydans DSM2003 is used to p roduce the 2－keto－g luco－nate，which is a p rimary p recursor for the synthesis of D－erythoribic acid(EA).One bacterium with high－yield p roduction capacity was obtained by self－adap ting to the high concentration of substrate，and the conversion rate had reached 24.68mmol/L/h in flask(tem perature at 30℃，pH at 6.0，cell concentration at 20g/L，substrate concentration at 1100mmol/L，shaking rate at 250r/m in).While catalysis was carried in the 7L fermentor under the op timum cond ition，the conversion rate of 2－KGA could reach 74mm ol/L/h and the cell could be reused effec tively for three tim es.

2－KGA;Gluconobacter oxydans;resting cell catalysis;p rocess op tim ization

TS201.3

A

1002－0306(2012)19－0177－05

2012－03－19 *通訊聯系人

陳鴻勝(1987－)，男，碩士，研究方向:生物催化合成工藝。

國家863重點項目(2011AA02A213)。