紫杉烷微生物轉(zhuǎn)化研究進展

蔣彭成，陳碧峰，鄭 水，唐 亮*

1長沙醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，長沙410000;2香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)系，香港100871;3云南大學(xué) 微生物研究所，昆明650091

微生物轉(zhuǎn)化(microbial transformation)是利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的酶對外源底物進行結(jié)構(gòu)修飾和改造的催化反應(yīng)，故又稱之為微生物酶法轉(zhuǎn)化。至目前為止，已經(jīng)從微生物中發(fā)現(xiàn)了3000余種能夠催化各種化學(xué)反應(yīng)的酶。近十幾年來，學(xué)者們已經(jīng)利用從微生物中獲得的脂肪酶和蛋白酶對多種天然多羥基化合物包括皂草苷類、黃酮苷類、生物堿類、甾醇類、倍半萜(烯)化合物、熊果苷和槐糖脂等進行了酶催化下的選擇性酯化反應(yīng)。

紫杉醇是天然植物類抗腫瘤新藥，是用于臨床效果最好、毒副作用最低的抗癌藥物之一［1］。目前，人們可能獲得紫杉醇的方法主要是直接從紅豆杉中提取、化學(xué)全合成以及化學(xué)半合成［2］。近年來，利用微生物將紫杉醇副產(chǎn)物(紫杉烷)轉(zhuǎn)變成紫杉醇的技術(shù)逐漸興起，極大的提高了紅豆杉的利用率，節(jié)約了大量紫杉醇資源植物。本文就現(xiàn)階段紫杉烷微生物轉(zhuǎn)化研究進行綜述。

1 BMS研究進展

目前對紫杉烷類化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究尚處于起步階段，目的性較弱的非定向轉(zhuǎn)化研究比較多。較為系統(tǒng)的工作是由美國施貴寶公司藥物研究協(xié)會(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)的R.N.Patel和R.L.Hanson領(lǐng)導(dǎo)的研究小組進行的，經(jīng)過長達十幾年的探索，已取得一定進展。

BMS 由 R.N.Patel 和 R.L.Hanson［3］領(lǐng)導(dǎo)的小組最成功的研究是利用微生物轉(zhuǎn)化進行紫杉醇的半合成。研究小組首先從白色類諾卡氏菌(Nocardioides albus)SC13911、藤黃類諾卡氏菌(Nocardioides luteus)SC13912、莫拉氏菌(Moraxella sp.)三種微生物中分離得到C-13側(cè)鏈水解酶、C-10脫乙酰酶、C-7木糖甙酶三種酶。分別將分離自Taxus hicksii幼苗中的數(shù)種紫杉烷(BaccatinⅢ、10-deacetyl Taxol、7-xylosyl Taxol 、7-xyloxyl-10-deacetyl Taxol、Cephalomannie等)的7、10及13位進行水解，得到較多單一的10-deacetyl BaccatinⅢ作為紫杉醇(或多烯紫杉醇)合成的前體。再將 Nocardioidesluteus SC13912所產(chǎn)的C-10脫乙酰酶固定化，以乙酸乙烯酯為酰基供體，把10-DAB乙酰化生成巴卡亭Ⅲ，其轉(zhuǎn)化率最高可達 51%［4，5］。

2 其它研究概況

其它對微生物轉(zhuǎn)化紫杉烷類化合物的研究主要涉及水解、酯化、羥基化、脫氫、差向異構(gòu)化等反應(yīng)類型。

2.1 水解反應(yīng)

2.1.1 7-木糖基水解

近年來，R.N.Patel和R.L.Hanson領(lǐng)導(dǎo)的小組還進行了其它方面的研究。他們發(fā)現(xiàn)Nocardioides luteus SC13912除具有C-10脫乙酰酶活性外，同時還具有C-6羥化酶活性。施貴寶公司還發(fā)現(xiàn)了一株莫拉氏菌(Morexella sp)能產(chǎn)生7-(-木糖甙酶，該酶能將10-脫乙酰-7木糖紫杉烷中的木糖基酶解掉。Wang［6］發(fā)現(xiàn)除施寶貴公司報道的莫拉氏菌(Morexella sp)外還有諸如鏈霉菌屬(Streptomyces)，如馬特鏈霉菌(Streptomyces matensis)，異硫鏈霉菌(Streptomyces althioticus，Streptomyces griseorubens)，類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)如Paenibacillus pabuli，無色桿菌屬(Achromobacter)，如 Achromobacter spanius，Achromobacter piechaudii.假單胞菌屬(Pseudomonas)，如惡臭假單胞菌(Pseudomonas Putida)，Pseudomonas asplenii等，都能產(chǎn)生分解7-木糖基紫杉烷中木糖基的酶(如圖1)。

圖1 7-木糖基紫杉醇木糖基反應(yīng)Fig.1 C-7 xylosidase of 7-xylosyl paclitaxel

2.1.2 乙酰基水解

除施貴寶(BMS)公司R.N.Patel和R.L.Hanson等篩選到的藤黃類諾卡氏菌(Nocardioides luteus)SC13912、紅球菌(Rhodococcus sp．)ATCC202191和ATCC202192具有脫乙酰基作用外。張君增［7］等從云南紅豆杉樹皮內(nèi)分離出的微生物中發(fā)現(xiàn)3株具有轉(zhuǎn)化天然紫杉烷類化合物的能力，其中 MicrospHaeropsis onychiuri和毛霉(Mucor sp.)都可水解10-脫乙酰-7-表紫杉醇的13位側(cè)鏈并可使7位羥基差向異構(gòu)化，而鏈格孢菌(Alternaria alternata)則在1β-羥基巴卡亭Ⅰ的不同位置進行水解。賈紅婷［8］以一株未鑒定的真菌“方21”對云南紅豆杉甲素(Yunnanxane)C-10位上的乙酰基進行特異性水解，生成10-deacetyl Yunnanxane，轉(zhuǎn)化產(chǎn)率在30%以上。李松［9］等，也發(fā)現(xiàn)一株可專一性水解巴卡亭Ⅲ的C-10位乙酰基成團泛菌Pamoea agglomerctn。

2.2 酰化反應(yīng)

圖2 10-DAB C-10位酰基化Fig.2 C-10 acetylation of 10-DAB

紫杉烷的 C13位側(cè)鏈的酰化和C5，C7，C10等位長的疏水側(cè)鏈都能發(fā)生酰化反應(yīng)。酰基水解酶在特定的條件下也是酰化酶。施貴寶公司將騰黃類諾卡氏菌產(chǎn)生的脫C-10乙酰酶固定化以乙烯基乙酸酯為供體將 10-DAB 轉(zhuǎn)化成 Baccatin-Ⅲ［4］(如圖2)。

2.3 羥基化反應(yīng)

Hu［10］等利用刺孢小克銀漢霉(Cunninghamella echinulata)對sinenxan A進行選擇性脫乙酰和羥基化反應(yīng)，當(dāng)pH值不同時，產(chǎn)物的種類和量都會有很大變化，證明了高pH條件下更易進行水解反應(yīng)。Shen［11］等用黑曲霉(Aspergillus niger)對 Baccatin Ⅵ和1β-Hydroxy BaccatinⅠ進行轉(zhuǎn)化，得到四個新紫杉烷衍生物。

2.4 脫氫與差向化反應(yīng)

A.Arnone［12］等用新月彎孢菌(Curvularia lunata)和毛栓菌(Trametes hirsute)對10-DAB進行轉(zhuǎn)化，分別使10-DAB的C-13位的羥基發(fā)生脫氫、C-7位差向化和C-10位脫氫等反應(yīng)，得到7-epi-10-DAB、7-epi-10-oxo-10-DAB等數(shù)種新產(chǎn)物。占紀勛［13］等對32株微生物(包括真菌和細菌)對紫杉醇進行微生物轉(zhuǎn)化的篩選，經(jīng)TLC檢測發(fā)現(xiàn)稻黃桿菌(Flavobacterium oryzae)AS1.1584、銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)AS1.860、普通變形菌(Proteus vulgaris)AS1.1208和極小短小桿菌(Curtobacterium pusillum)AS1.1905均具有轉(zhuǎn)化紫杉醇的能力。

3 展望

雖然目前大部分微生物轉(zhuǎn)化工作還停留在初級的新反應(yīng)篩選和發(fā)現(xiàn)上，但微生物轉(zhuǎn)化的作用不可忽視。今后，在繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的同時，要加大力度對重要的反應(yīng)進行深入研究，通過優(yōu)化反應(yīng)條件、誘變菌株、提純重要的酶、克隆酶的基因等手段，并結(jié)合固定化技術(shù)、基因重組技術(shù)，不斷提高轉(zhuǎn)化效率和延長菌株或酶的使用時間，充分發(fā)揮微生物轉(zhuǎn)化的長處，為新藥研究提供強有力的支持。相信，微生物轉(zhuǎn)化研究將在紫杉醇類藥物合成和結(jié)構(gòu)修飾中繼續(xù)發(fā)揮重要作用。

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