SEC－MALLS法測定羥乙基淀粉130/0.4重均分子量及分子量分布

宋彥會，杜中海，于 鵬，任傳杰，袁洪雨

(山東齊都藥業(yè)有限公司，山東淄博255400)

羥乙基淀粉(Hydroxythyl starch，HES)是玉米支鏈淀粉經(jīng)酸水解，然后在堿性條件下經(jīng)羥乙基化而成，是目前較受關(guān)注的一類膠體性血容量擴充劑，主要用于大出血、大面積燒傷、重癥監(jiān)護或手術(shù)病人，用以擴充血容量，改善微循環(huán)［1，2］。目前臨床上常用的是新一代的 HES130/0.4氯化鈉注射液［3］。

在有關(guān)控制羥乙基淀粉質(zhì)量的指標中，羥乙基化程度對藥物體內(nèi)保留時間有決定性作用，而羥乙基淀粉的擴容強度主要取決于重均分子量及分子量分布［4］。

目前多用尺寸排阻色譜法(SEC)測定羥乙基淀粉重均分子量及分子量分布，其原理是高聚物溶液流過凝膠柱時分子按體積大小順序流出，重均分子量(Mw)的對數(shù)值與保留時間(TR)呈線性關(guān)系。通過測定不同分子量對照品，可得重均分子量(Mw)的對數(shù)值與保留時間的線性回歸方程lgMw=a+bTR。通過測定待測樣品的保留時間，可據(jù)此回歸方程計算出待測樣品的相對重均分子量(Mw)。該方法屬于間接測定方法，需使用不同分子量羥乙基淀粉對照品繪制標準曲線，誤差較大。

激光光散射法是測定高分子物質(zhì)重均分子量的直接方法。高分子溶液可視為不均勻介質(zhì)，當光通過它時，入射光的電磁波誘導高分子成為振蕩偶極子，并產(chǎn)生強迫振動作為二次光源發(fā)出散射光。高分子溶液的散射光強度遠遠高于其溶劑，并且強烈依賴于高分子的分子量、鏈形態(tài)、溶液濃度、散射光角度和折光指數(shù)增量(dn/dc值)等基本參數(shù)，從而得到高分子物質(zhì)的絕對分子量。當激光光散射儀與分子排阻色譜聯(lián)用時，分子排阻色譜實現(xiàn)不同分子量高聚物分子的分離，分子按大小順序依次進入十八角度激光光散射儀確定分子量，繪制出分子量分布圖，直接測定出絕對重均分子量及分子量分布，不需要同結(jié)構(gòu)對照品繪制標準曲線，完全不依賴未知樣品與標樣結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的相似性，能快速、準確地測定物質(zhì)的重均、數(shù)均和Z均分子量及分子量分布［5］。該法操作簡便，誤差小。

本文對SEC－MALLS法進行了方法學研究，并用此法測定了本公司連續(xù)生產(chǎn)三批羥乙基淀粉130/0.4的重均分子量及分子量分布，結(jié)果證明該方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，適用于羥乙基淀粉的重均分子量及分子量分布檢測。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Wyatt DAWN HELEOS－Ⅱ十八角度激光光散射儀(美國懷雅特公司);Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);BS110S電子天平(d=0.1 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試藥 中分子量羥乙基淀粉對照品(歐洲藥典委員會，Code:Y0001277，Mw:130 100);純化水，羥乙基淀粉 130/0.4(山東齊都藥業(yè)有限公司，批號:110601、110602、110603)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:預柱TSKgel Guard column pwxl(4 cm×6 mm)，分離柱 TSKgel G4000 pwxl(30 cm ×7.8 mm)2根串聯(lián);檢測器:十八角度激光光散射檢測器和示差折光檢測器在相同溫度聯(lián)用;流動相:取醋酸鈉18.7 g，加疊氮鈉1.72 g，加水4 000 mL 溶解，加冰乙酸34.5 mL，加水至5 000 mL;流速:0.5 mL·min－1;柱溫:35 ℃;進樣體積:50 μL;流動相折光指數(shù):1.334;dn/dc:0.135 mL·g－1;二次維里系數(shù)A2:10－4mol·mL·g－1。

2.2 測定法 照如下方法測定。本品重均分子量應為110 000～150 000，10%大分子重均分子量不得大于380 000，10%小分子重均分子量不得小于15 000。

測定法:取本品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含20 mg的溶液，搖勻，經(jīng) 0.2 μm 過濾，取 50 μL 續(xù)濾液注入液相色譜儀，記錄結(jié)果，計算，即得。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 取中分子量羥乙基淀粉適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含20 mg的溶液，搖勻，經(jīng) 0.2 μm 過濾，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含20 mg的溶液，搖勻，經(jīng)0.2 μm過濾，即得。

2.4 SEC－MALLS方法學考察

2.4.1 專屬性考察 精密量取對照品溶液、供試品溶液(批號:110601)及流動相各50 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明流動相對供試品無干擾，該方法專屬性強，測定結(jié)果見圖 1、2。

圖1 空白溶劑

圖2 羥乙基淀粉130/0.4(批號:110601)供試品

2.4.2 準確度試驗 取中分子量羥乙基淀粉對照品適量，加流動相溶解并分別稀釋制成每1 mL中約含16 mg、20 mg、24 mg的溶液，每個濃度各分別制備3份溶液，搖勻，經(jīng)0.2 μm過濾，精密量取50 μL續(xù)濾液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測得中分子量羥乙基淀粉對照品重均分子量(Mw)平均值為130 078，RSD為0.14%，平均值與標稱值之差為22，相對誤差為0.02%，小于5%，可見，該方法準確度高，測定結(jié)果見表1。

表1 準確度試驗

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液(批號:110601)，室溫放置0、12、24、36 h后分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明本品在36 h內(nèi)穩(wěn)定性好，測定結(jié)果見表2。

2.4.4 重復性試驗 取本品(批號:110601)適量，加流動相溶解并分別稀釋制成每1 mL中約含16 mg、20 mg、24 mg的溶液，每個濃度各分別制備3份溶液，搖勻，經(jīng)0.2 μm過濾，精密量取50 μL續(xù)濾液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，RSD為0.15%，表明該方法重復性好，測定結(jié)果見表3。

表2 溶液穩(wěn)定性試驗

表3 重復性試驗

2.5 重均分子量及分子量分布的測定 取供試品溶液(批號:110601、110602、110603)，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，三批供試品重均分子量均在110 000～150 000，10%大分子部分重均分子量均小于380 000，10%小分子部分重均分子量均大于15 000，測定結(jié)果見表4。

3 討論

通過上述方法學驗證，結(jié)果表明該方法準確度高、重現(xiàn)性好，完全不依賴未知樣品與標樣結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的相似性，能快速、準確地測定物質(zhì)的重均、數(shù)均和Z均分子量及分子量分布，適合羥乙基淀粉130/0.4重均分子量及分子量分布檢測。

表4 羥乙基淀粉200/0.5重均分子量及分子量分布測定結(jié)果

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［3］Gallandat Huet RC，Siemons AW，Baus D，et al.A novel hydroxyethyl starch(Voluven)for effective perioperative plasma volume substitution in cardiac surgery［J］.Can J Anaesth，2000，47(12):1207 －1215.

［4］羅逸，劉菊蓉，郭興蓬，等.合成產(chǎn)物羥乙基淀粉主要質(zhì)控指標研究［J］.藥物分析雜志，2004，24(3):296－298.

［5］左榘.激光散射原理及在高分子科學中的應用［M］.鄭州:河南科學技術(shù)出版社，1994:48，229.