雙模板大豆異黃酮類特異性分子印跡聚合物微球的制備及性能研究

李 超，石 波，張夢(mèng)柯，韭澤悟，程永強(qiáng)，*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081; 3.日本國(guó)際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心，筑波305－8686，日本)

雙模板大豆異黃酮類特異性分子印跡聚合物微球的制備及性能研究

李 超1，石 波2，張夢(mèng)柯1，韭澤悟3，程永強(qiáng)1，*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081; 3.日本國(guó)際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心，筑波305－8686，日本)

為探尋大豆異黃酮類物質(zhì)的富集分離的新方法和新思路，選用染料木苷和大豆苷含量總和為89.2%的大豆異黃酮為模板，采用沉淀聚合法，以4－乙烯基吡啶(4－VP)為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，成功制備了分子印跡聚合物微球，并對(duì)微球進(jìn)行了吸附靜態(tài)學(xué)、吸附動(dòng)力學(xué)、類特異選擇性和結(jié)構(gòu)表征研究。通過(guò)紫外光譜法研究了模板分子與功能單體的相互作用，結(jié)果顯示4－VP和模板分子作用強(qiáng)烈，模板分子和4－VP最佳摩爾質(zhì)量比為1∶6。靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)表明印跡聚合物(MIP)與非印跡聚合物(NIP)相比，MIP對(duì)模板分子具有明顯的特異性吸附。吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明聚合物微球在5h內(nèi)對(duì)模板分子達(dá)到飽和吸附。類特異選擇性實(shí)驗(yàn)表明MIP對(duì)多種大豆異黃酮類單體組分具有明顯的類特異性吸附，特異吸附量高。此印跡聚合物微球有望在大豆苷異黃酮富集、分離、檢測(cè)方面得到廣泛的研究和應(yīng)用。

染料木苷，大豆苷，類特異性，聚合物微球

分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique，M IT)是指以某一特定的目標(biāo)分子為模板，制備對(duì)該分子具有特異選擇性聚合物的過(guò)程［1］。該技術(shù)制備的分子印跡聚合物具有高親和性和選擇性、抗惡劣環(huán)境能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、使用壽命長(zhǎng)、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，分子印跡技術(shù)在很多領(lǐng)域，如固相萃取、色譜分離、仿生傳感、模擬酶催化等方面得到廣泛的研究和開(kāi)發(fā)，在食品工業(yè)、天然活性成分分離、環(huán)境監(jiān)測(cè)等行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用，分子印跡技術(shù)已成為近年來(lái)研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)［1－4］。本實(shí)驗(yàn)選擇較高純度的大豆異黃酮(主要含有染料木苷和大豆苷兩種單體，結(jié)構(gòu)如圖1所示)為模板分子，采用沉淀聚合法，合成了基于染料木苷和大豆苷為主的雙模板大豆異黃酮類特異性分子印跡聚合物微球，并對(duì)其性能進(jìn)行了研究，為今后大豆異黃酮類活性成分分離純化、特異選擇性吸附材料的制備提供了理論依據(jù)。

圖1 黃酮母環(huán)、染料木苷和大豆苷結(jié)構(gòu)式［5－7］Fig.1 Structure of flavonoid，genistin and daidzin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆異黃酮 染料木苷含量為77.4%，大豆苷含量為11.8% 吉林省大豆研究中心提供;大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、黃豆苷、黃豆黃素、橙皮苷、蘆丁 上海同田生物技術(shù)公司;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、4－乙烯基吡啶(4－VP)、丙烯酸(AA)、丙烯酰胺(AM)、甲基丙烯酸(MAA) Sigma公司;甲醇、乙酸 化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán);乙腈、甲醇 色譜純，F(xiàn)ishmer scientific公司。

高壓輸液泵 2695、紫外檢測(cè)器 2996 美國(guó)Waters公司;色譜柱GEA C18(4.6mm×250mm，5μm)北京金歐亞有限公司;高速臺(tái)式離心機(jī)TGL－18C上海安亭公司;傅里葉變換紅外光譜儀Varian660美國(guó)安捷倫公司;場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡Quanta 200F FEI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相(HPLC)檢測(cè)條件 流動(dòng)相:乙腈(A相)、含0.1%(V/V)冰醋酸的水溶液(B相);梯度洗脫;流速:1m L/min;檢測(cè)波長(zhǎng):260nm;柱溫:40℃;進(jìn)樣量20μL;分析時(shí)間為62m in。檢測(cè)程序如圖2所示。

圖2 大豆異黃酮HPLC梯度洗脫時(shí)間程序Fig.2 The diagram of gradient elution program

1.2.2 紫外光譜法分析模板與功能單體相互作用固定大豆異黃酮的濃度為558.6μg/m L(其中染料木苷濃度為0.001mmol/m L)，分別加入不同量的AA、4－VP、AM、MAA的功能單體溶液，振蕩后放置12h，分別以相同濃度的各功能單體溶液做參比，檢測(cè)大豆異黃酮紫外光譜的變化。

1.2.3 基于雙模板(染料木苷和大豆苷)為主的大豆異黃酮分子印跡聚合物微球的制備 準(zhǔn)確稱取55.87mg(含有0.1mmol染料木苷)大豆異黃酮原料溶于80m L甲醇中，再加入68.4μL(約0.6mmol)4－VP，于振蕩器中振蕩4h，以使大豆異黃酮與4－VP充分相互作用。依次加入0.57m L(約3mmol)交聯(lián)劑EGDMA和40mg引發(fā)劑AIBN，將溶液置入試劑瓶中超聲脫氣10min，然后向其中通氮?dú)?0m in，密封后，將其置入恒溫水浴槽中，60℃下聚合反應(yīng)24h。將產(chǎn)物以10000 r/min高速離心10min，取沉淀，用9∶1 (V/V)的甲醇/乙酸洗脫液索式抽提至HPLC檢測(cè)洗脫液無(wú)模板分子為止，置于真空干燥箱干燥24h備用。NIP除聚合中未加入大豆異黃酮外，其余步驟相同［8－11］。

1.2.4 聚合物微球靜態(tài)等溫吸附線的測(cè)定 準(zhǔn)確稱量10份100mg MIP，分別加入不同濃度的大豆異黃酮溶液，30℃下振蕩24h，使吸附達(dá)到平衡，以10000r/min的速度離心沉降10m in取上清液，高效液相檢測(cè)吸附平衡后上清液中大豆苷和染料木苷的濃度，根據(jù)吸附量計(jì)算公式計(jì)算MIP對(duì)大豆苷和染料木苷的吸附量。以大豆異黃酮濃度為橫坐標(biāo)，M IP對(duì)大豆苷和染料木苷的吸附總量為縱坐標(biāo)，做出等溫吸附線。NIP等溫吸附線的測(cè)定方法相同。

其中:Q為吸附量(μg/g);C1為吸附前溶液中的大豆苷或染料木苷的濃度(μg/m L);C2為吸附達(dá)到平衡后的上清液中大豆苷或染料木苷的濃度(μg/m L);V為吸附液的體積(m L);M為MIP或NIP的質(zhì)量(mg)。

1.2.5 聚合微球吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱量12份100mg MIP，加入相同濃度的大豆異黃酮溶液10m L，30℃下振蕩吸附。分別在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12h取出離心，檢測(cè)上清液中大豆苷和染料木苷濃度。根據(jù)吸附量計(jì)算公式計(jì)算M IP對(duì)大豆苷和染料木苷的吸附量。以大豆異黃酮濃度為橫坐標(biāo)，MIP對(duì)大豆苷和染料木苷的吸附總量為縱坐標(biāo)，做出吸附動(dòng)力學(xué)曲線。NIP吸附動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定方法相同。

1.2.6 聚合物微球的類特異選擇性吸附實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱量8份100mg印跡聚合物，分別加入適當(dāng)濃度的染料木苷、大豆苷、黃豆苷、染料木素、大豆苷元、黃豆黃素、蘆丁、橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)方法分別測(cè)定平衡飽和吸附量。評(píng)價(jià)聚合物的類特異選擇吸附效果。

1.2.7 聚合物紅外光譜和掃描電鏡分析 利用Varian660傅里葉變換紅外光譜儀，采用KBr壓片法，分別對(duì)MIP和NIP進(jìn)行紅外光譜分析。利用Quanta 200F場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡對(duì)M IP和NIP表面結(jié)構(gòu)和粒徑進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 功能單體種類的選擇

MIP的制備過(guò)程中，模板分子和功能單體通過(guò)非共價(jià)鍵作用(如氫鍵)或者共價(jià)鍵的作用形成穩(wěn)定的復(fù)合體是影響聚合物的高選擇、高吸附性能的關(guān)鍵因素。從大豆異黃酮兩種主要單體染料木苷和大豆苷的分子結(jié)構(gòu)來(lái)看，染料木苷和大豆苷都具有相同的黃酮類母環(huán)結(jié)構(gòu)，而且具有酚羥基，呈現(xiàn)弱酸性。從理論上講，堿性功能單體更有利于和酸性模板形成穩(wěn)定的主客體復(fù)合物［12－14］。

圖3是使用4種功能單體(AA、4－VP、AM、MAA)，在模板分子與功能單體的不同的摩爾比例(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8)下相互作用之后的紫外光譜圖。從(b)中可以看出，4－VP與模板分子的相互作用更加強(qiáng)烈，隨著4－VP的濃度增大，大豆異黃酮的紫外最大吸收波長(zhǎng)(260nm處)發(fā)生明顯的紅移，而其他三種則沒(méi)有明顯的變化。由此可推斷，4－VP為理想的功能單體，4－VP本身表現(xiàn)為堿性，可以和模板發(fā)生酸堿作用，而且可以提供氫鍵受體和模板發(fā)生相互作用產(chǎn)生氫鍵，有利于印跡聚合物識(shí)別位點(diǎn)的產(chǎn)生。在1∶6時(shí)，紅移最大波長(zhǎng)達(dá)到400nm，繼續(xù)增加功能單體，波長(zhǎng)幾乎不再發(fā)生移動(dòng)，表明功能單體并非越多越好，只要功能單體和模板相互作用充分即可，過(guò)多的功能單體會(huì)導(dǎo)致聚合物非選擇性位點(diǎn)、非特異性吸附增加。綜合考慮，選擇4－VP為功能單體，模板分子與功能單體物質(zhì)的量比為1∶6來(lái)制備大豆異黃酮分子印跡聚合物微球。

圖3 大豆異黃酮與不同功能單體相互作用紫外光譜圖Fig.3 The interaction UV spectra of soy isoflavones with different functionalmonomers

2.2 靜態(tài)等溫吸附性能評(píng)價(jià)

圖4是MIP和NIP在不同大豆異黃酮濃度下的靜態(tài)等溫吸附性能曲線，從圖4中可以明顯的看出，隨著大豆異黃酮底物濃度的不斷增加，最初MIP和NIP對(duì)大豆異黃酮溶液中的染料木苷和大豆苷的吸附總量增長(zhǎng)迅速，但當(dāng)濃度達(dá)到一定的量時(shí)，繼續(xù)增加濃度，MIP和NIP對(duì)染料木苷和大豆苷的吸附總量趨于飽和。而且MIP對(duì)染料木苷和大豆苷的吸附總量明顯大于NIP，特異吸附效果顯著。這是由于M IP在合成中洗脫掉模板之后，形成了很多對(duì)染料木苷和大豆苷結(jié)構(gòu)匹配的空間孔穴結(jié)構(gòu)，因此對(duì)染料木苷和大豆苷具有較大的吸附量。而NIP在合成中未加入模板，形成的聚合物中功能團(tuán)分布無(wú)序，沒(méi)有形成對(duì)染料木苷和大豆苷分子空間結(jié)構(gòu)匹配的識(shí)別位點(diǎn)，導(dǎo)致吸附總量遠(yuǎn)低于M IP。由此可知，合成的MIP對(duì)染料木苷和大豆苷具有較大的吸附量，且具有一定的特異選擇識(shí)別性能。

圖4 MIP和NIP的等溫線Fig.4 The binding isotherm diagram of MIP and NIP to genistin and daidzin

2.3 聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)

圖5是MIP和NIP在相同大豆異黃酮濃度下，對(duì)大豆苷和染料木苷吸附總量隨時(shí)間變化的趨勢(shì)。由圖可看出，MIP和NIP對(duì)大豆苷和染料木苷的吸附總量在前5h內(nèi)迅速增加，5h后，M IP和NIP對(duì)大豆苷和染料木苷的吸附達(dá)到平衡，吸附總量不再增加，吸附達(dá)到飽和。這是由于MIP在合成中將模板分子洗脫掉后，由功能單體和交聯(lián)劑形成的空間立體孔穴分布深淺不一，吸附開(kāi)始時(shí)，主要是聚合物微球外表面對(duì)模板分子的吸附，吸附速度較快。當(dāng)外表面吸附達(dá)到飽和后，底物主要是通過(guò)外表面向聚合物微球內(nèi)部擴(kuò)散傳質(zhì)，傳質(zhì)阻力加大，導(dǎo)致吸附結(jié)合的速度下降，當(dāng)吸附達(dá)到平衡后，吸附總量達(dá)到飽和。

表1 聚合物對(duì)不同底物的吸附量(μg/g)Table 1 The absorption of polymer to different substrates(μg/g)

圖5 MIP和NIP對(duì)染料木苷和大豆苷的吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5 The adsorption kinetic curve of MIP and NIP to genistin and daidzin

2.4 聚合物微球的類特異選擇吸附性能評(píng)價(jià)

表1為MIP和NIP對(duì)不同底物的飽和吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由表可知，NIP對(duì)8種底物的飽和吸附量相差不大，這是由于NIP在合成中沒(méi)有加入模板，即沒(méi)有形成具有識(shí)別性能的孔穴。MIP對(duì)8種底物的吸附量明顯大于NIP，這是因?yàn)镸IP中含有很多固定功能基團(tuán)的孔穴，而且這些功能基團(tuán)具有與異黃酮類物質(zhì)分子空間構(gòu)型相鍵合的識(shí)別能力。因此MIP具有較高的特異識(shí)別性、選擇性，NIP卻不具備此能力。

聚合物微球?qū)?種底物的飽和吸附量差值Q(MIP－NIP)差別顯著，其中對(duì)染料木苷和黃豆黃苷的吸附量最大，這是由于MIP合成時(shí)所使用的大豆異黃酮模板中染料木苷占主要成分，染料木苷和黃豆黃苷無(wú)論是分子結(jié)構(gòu)還是空間構(gòu)型上的極為相似，使得MIP在吸附染料木苷和黃豆黃苷方面很難具備高度特異吸附性。在對(duì)大豆苷、染料木素、大豆苷元、黃豆黃素特異吸附方面，MIP也表現(xiàn)出較高的吸附量。這是由于大豆苷在M IP合成中充當(dāng)?shù)诙０宸肿樱又@四種單體都具備黃酮類典型母環(huán)結(jié)構(gòu)，所以表現(xiàn)出較高的特異吸附能力。在對(duì)橙皮苷、蘆丁特異吸附方面，MIP對(duì)這兩種單體的特異吸附量相對(duì)較小，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)分析，可能是由于這兩種單體分子結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)糖環(huán)，分子空間體積的增大加大了分子進(jìn)入MIP印跡孔穴中的阻力，孔穴中的特異識(shí)別位點(diǎn)無(wú)法與這兩種單體產(chǎn)生較好的鍵合作用所致［15］。印跡聚合物微球?qū)煞N模板分子的吸附量上，染料木苷的吸附量明顯大于大豆苷，對(duì)染料木苷具有明顯的選擇性，而對(duì)大豆苷的選擇吸附能力較差，很可能是由于染料木苷在模板中所占的比重較大，大豆苷較小，聚合物中形成的印跡孔穴大多數(shù)和染料木苷具有較好的匹配度，對(duì)染料木苷具有較好的選擇吸附能力。總之，合成的印跡聚合物對(duì)類黃酮物質(zhì)具有一定的類特異選擇吸附性能。

2.5 結(jié)構(gòu)表征與形態(tài)分析2.5.1 紅外光譜分析 圖6(a)、(b)、(c)分別為NIP、M IP和大豆異黃酮的紅外光譜。比較(a)和(b)兩圖可知:(a)中1636.18cm－1和(b)中1636.00cm－1處峰為聚合物中交聯(lián)劑EGDMA的C=C雙鍵的伸縮振動(dòng)峰，(a)中1597.97cm－1和(b)中1598.82cm－1處峰為功能單體4－VP的功能鍵吡啶氮C=N的峰［16－17］。C=C雙鍵峰和C=N的峰很小，表明交聯(lián)劑和功能單體4－VP大部分發(fā)生了交聯(lián)聚合反應(yīng)，只有很少一部分的殘留［18］。4－VP的功能鍵吡啶氮C=N的峰波長(zhǎng)發(fā)生了微弱的變化，很可能是由于M IP在合成過(guò)程中4－VP功能鍵吡啶氮C=N受到模板分子的作用以及模板去除后空間孔穴的形成引起的周圍環(huán)境的改變等原因所致，這更加說(shuō)明得到的印跡聚合物中含有與模板分子相互作用的功能基團(tuán)，這為聚合物特異識(shí)別位點(diǎn)的形成創(chuàng)造了有利條件。

圖6 NIP、MIP和大豆異黃酮紅外光譜Fig.6 The infrared spectrogram of differentmaterials

整體觀察MIP、NIP和大豆異黃酮圖譜，NIP和M IP均有明顯的羥基、羰基、酯基C－O－C等吸收峰，而且這些峰的峰形基本上一致，對(duì)照M IP和大豆異黃酮圖譜，未在MIP中發(fā)現(xiàn)明顯與大豆異黃酮中相同的吸收峰，說(shuō)明MIP中的模板分子已基本上洗脫干凈。

2.5.2 掃描電鏡分析 圖7為NIP(a)和MIP(b)的掃描電鏡圖，NIP和M IP都形成了粒徑較為均一的微球，NIP微球表面光滑，MIP微球表面相對(duì)于NIP微球表面較為粗糙，出現(xiàn)明顯的凸凹不平的坑，比表面積比NIP的比表面積要大，比表面積的變大有利于吸附量的增加。比較兩者微球的平均粒徑可知，MIP的粒徑比NIP大，這很可能是由于MIP在合成過(guò)程中添加了模板，經(jīng)過(guò)溶脹聚合、模板洗脫后在微球表面和內(nèi)部形成很多印跡“孔穴”，這些“孔穴”占據(jù)一定的體積，使得微球外觀表現(xiàn)為粒徑變大［19］。

圖7 NIP(a)和MIP(b)的掃描電鏡圖Fig.7 The scanning electronmicrograph of NIP(a)and MIP(b)

3 結(jié)論

采用沉淀聚合法，以染料木苷和大豆苷含量總和為89.2%的大豆異黃酮為模板分子，4－VP為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，甲醇為致孔劑，AIBN為引發(fā)劑，合成了對(duì)大豆異黃酮具有類特異選擇吸附能力的分子印跡聚合物微球。紫外光譜法確定了4－VP為功能單體，染料木苷和4－VP的最適摩爾質(zhì)量比例為1∶6。靜態(tài)等溫吸附實(shí)驗(yàn)表明，MIP的吸附量明顯高于NIP，對(duì)染料木苷和大豆苷具有較高的特異吸附量。吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，5h時(shí)，MIP和NIP對(duì)染料木苷和大豆苷的吸附量達(dá)到吸附平衡。類特異選擇性實(shí)驗(yàn)表明，MIP對(duì)大豆異黃酮類物質(zhì)具有明顯的類特異選擇吸附性能，對(duì)具有典型大豆異黃酮母環(huán)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)具較高的識(shí)別能力。紅外光譜和掃描電鏡表明M IP中形成了固定的功能基團(tuán)和用于識(shí)別模板分子的印跡孔穴。此MIP有望在大豆異黃酮類物質(zhì)的富集、分離、純化、固相萃取、色譜分離以及工業(yè)制備大豆異黃酮特異吸附材料方面得到進(jìn)一步的應(yīng)用。

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Preparation and characteristics of soy isoflavone class－specific molecularly im print polymerm icrospheres based on two tem plates

LIChao1，SHIBo2，ZHANG M eng－ke1，STAORU Nirasawa3，CHENG Yong－qiang1，*
(1.Food Sciense and Nutritional Engineering College，China Agricultural University，Beijing 100083，China; 2.Feed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China; 3.Japan International Research Center for Agricultural Sciences，Tsukuba 305－8686，Japan)

The soy isoflavone molecularly im p rint polymer m icrospheres was synthesized by p recipitation polymerization in order to develop a new way of soy isoflavone enrichment and separation.Methods using soy isoflavone that the total contents of genistin and daidzin in soy isoflavone were 89.2 percents were used as tem p late molecular，4－vinyl pyrid ine(4－VP)were used as the functionalmonomer，ethylene g lycol dimethacrylate (EGDMA)were used as the c ross－linking agent，azod iisobutyronitrile(AIBN)were used as initiator.The characteristics of soy isoflavone c lass－specific molecularly im p rint polymer m icrospheres were evaluated by means of static and dynam ic adsorp tion experiments，also by c lass－specific selec tive experim ents，structure and shape charac terization research m ethod.UV spec tromertry was em p loyed to demonstrate the mechanism of the interac tion between tem p late m olecular and four kinds of functionalm onomers.The results showed that the 4－VP interac ted powerfully w ith the tem p late molecular and the interac tion effect was bestwhen the m ole ratio was 1∶6 between the temp late molecular and the 4－VP.The static adsorp tion experiments results showed that MIP had a good specific adsorp tion effect com pared w ith NIP.The dynam ic adsorp tion experiments results showed that the polymerm ic rospheres would reach to saturated adsorp tion in 5h.The c lass－specific selec tive experiments results showed that M IP had a good c lass－specific selec tive effec t and also a high absorp tion to various com ponents of soy isoflavone.This molecularly imp rint polymerm icrospheres are expected to be further research and app lication in the further in enriching，separating and checking the soy isoflavones.

genistin;daidzin;c lass－specific;polymerm icrospheres

TS201.2

A

1002－0306(2012)19－0053－05

2012－03－30 *通訊聯(lián)系人

李超(1987－)，男，碩士，研究方向:天然產(chǎn)物與功能食品。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972286，31171628);北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)計(jì)劃(2011D009007000001)資助。