嗜熱棉毛菌圈體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶條件的優(yōu)化

范光森，楊紹青，閆巧娟，嚴 燁，江正強，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083;

2.中國農(nóng)業(yè)大學工學院，北京 100083)

嗜熱棉毛菌圈體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶條件的優(yōu)化

范光森1，楊紹青1，閆巧娟2，嚴 燁1，江正強1，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083;

2.中國農(nóng)業(yè)大學工學院，北京 100083)

通過單因素實驗優(yōu)化了嗜熱棉毛菌CAU44利用農(nóng)業(yè)廢棄物固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件。結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳碳源為玉米芯和麥麩以4∶6混合的復合碳源，最佳氮源為(NH4)2SO4，最佳水分含量為80%，培養(yǎng)基最佳初始pH為4.0，最佳表面活性劑及添加量為0.5%的Tween－60。在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下50℃培養(yǎng)7d，嗜熱棉毛菌CAU44產(chǎn)木聚糖酶的酶活力最高，達到20343U/g干基碳源，為目前國內(nèi)報道的最高值。因此，嗜熱棉毛菌CAU44在利用農(nóng)業(yè)廢棄物固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶方面有很大的應用前景。

嗜熱棉毛菌，木聚糖酶，固體發(fā)酵，農(nóng)業(yè)廢棄物

木聚糖是主鏈由木糖殘基以β－1，4糖苷鍵連接而成的一類可再生的半纖維素類物質(zhì)，其有效降解對于自然界的碳循環(huán)至關重要。木聚糖酶(EC.3.2.1.8)是一類重要的木糖苷鍵水解酶，它能夠以內(nèi)切方式作用于木聚糖分子中的β－1，4木糖苷鍵，將木聚糖水解生成低聚木糖和木糖。木聚糖酶可以廣泛應用于食品、飼料、造紙、能源等行業(yè)，具有廣闊的應用前景。相對于液體發(fā)酵，固體發(fā)酵由于具有生產(chǎn)成本低、工藝簡單，對工廠機械設備和能源等的要求不高、不易污染雜菌、無廢液，對環(huán)境友好等優(yōu)點，在酶制劑的生產(chǎn)方面具有一些獨特的優(yōu)勢［1］，近年來逐漸受到了眾多研究者的關注。國際上已有許多真菌固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的研究報道［2－3］。Chapla等［2］優(yōu)化了臭曲霉(Aspergillus foetidus)利用農(nóng)業(yè)廢棄物小麥麩皮固體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件，最終產(chǎn)酶水平達到了 8450U/g干基碳源。Gaffney等［3］研究了嗜熱棉毛菌利用麥麩固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶，通過優(yōu)化發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量，最終使酶活力達到2335U/g干基碳源［3］。國內(nèi)關于真菌固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的研究相對較少［4－6］。耐熱木聚糖酶因其具有很好的熱穩(wěn)定性和應用適應性，目前已成為木聚糖酶研究的熱點。嗜熱真菌是目前耐熱木聚糖酶生產(chǎn)的主要菌株。國際上已有許多嗜熱真菌產(chǎn)耐熱木聚糖酶的研究報道，如耐熱子囊菌 (Thermoascusaurantiacus)［7］、嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)［8］、嗜 熱 擬 青 霉(Paecilomycesthermophila)［9］以 及 嗜 熱 棉 毛 菌(Thermomyces lanuginosus)［10－11］等，其中嗜熱棉毛菌是迄今已報道的最好的木聚糖酶生產(chǎn)菌株之一［6］。目前，關于嗜熱棉毛菌產(chǎn)耐熱木聚糖酶研究主要集中在酶的分離純化以及酶學性質(zhì)上［10－11］，而關于其固體發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化的研究報道相對較少。本實驗室在前期的研究工作中從自然界篩選得到了一株嗜熱棉毛菌CAU44，并對其液體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶進行了研究，發(fā)現(xiàn)該菌能夠高產(chǎn)木聚糖酶［12］。本文擬繼續(xù)采用固體發(fā)酵的方式，研究嗜熱棉毛菌CAU44利用農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)耐熱木聚糖酶的發(fā)酵條件，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱棉毛菌CAU44 由中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院酶工程研究室保存［12］;樺木木聚糖、木糖 購于Sigma公司;低分子量標準蛋白樣品 購于TaKaRa公司;酵母提取物、胰蛋白胨 購于英國Oxoid公司;其他試劑 均為分析純。

LRH－恒溫恒濕培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠; TU－1800PC紫外分光光度計 北京普析通用儀器設備有限責任公司;Power Pac Basic TM電泳儀 美國BIO－RAD公司;GL－20B高速冷凍離心機 上海安亭科技儀器廠。

1.2 固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶

孢子懸液的制備:待嗜熱棉毛菌CAU44在PDA (土豆培養(yǎng)基)斜面上培養(yǎng)5d孢子完全萌發(fā)后，加入10mL無菌水，用滅菌的接種環(huán)輕輕刮動培養(yǎng)基表面，制成孢子懸液，混勻后用血球計數(shù)板計孢子數(shù)，調(diào)整孢子懸液的濃度為106個/mL。

營養(yǎng)鹽溶液(g/L):KH2PO41，NaCl 2.5，MgSO4· 7H2O 0.5，(NH4)2SO41，CaCl20.5，調(diào)節(jié)pH為7.0(考察pH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響時，分別調(diào)節(jié)至需要pH)。

發(fā)酵培養(yǎng):在250mL三角瓶中加入5g烘干后過篩(篩孔0.45～0.9mm)的農(nóng)業(yè)廢棄物和20mL營養(yǎng)鹽溶液，攪拌均勻，121℃滅菌30min，冷卻后接種1mL孢子懸液(106個/mL)，混勻后置于50℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)5d。

粗酶液的提取:每克固體發(fā)酵物加入10mL 50mmol/L，pH 6.2的檸檬酸緩沖液，30℃下200r/min震蕩提取2h，10000×g冷凍離心10min，吸取上清液即為木聚糖酶的粗酶液。

1.3 發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

采用單因素法優(yōu)化嗜熱棉毛菌CAU44固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的條件。選用不同的農(nóng)業(yè)廢棄物作為單一碳源考察碳源對產(chǎn)酶的影響，在前面產(chǎn)酶結(jié)果的基礎上研究兩種最優(yōu)碳源的復配，得到產(chǎn)酶水平最高的碳源組成比例，接著逐一考察氮源、pH、表面活性劑、水分含量以及發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響。實驗中均在前一個最佳發(fā)酵條件的基礎上優(yōu)化下一個參數(shù)。

1.4 酶活力及蛋白濃度的測定

采用DNS法［13］測定木聚糖酶的酶活力:0.1mL適當稀釋的酶液，加入到0.9mL 1%的樺木木聚糖底物溶液中(用50mmol/L，pH 6.5的MOPS緩沖液配制)，50℃水浴反應10min后加入1mL DNS試劑，煮沸終止反應并顯色，測定所釋放的還原糖量，同時以木糖作為標準。木聚糖酶的活力單位定義為:在上述反應條件下，每分鐘生成1μmol木糖所需要的酶量。酶活力計算公式為:

A=(k×OD540+b)×n

式中:A為酶活力，k為標準曲線斜率，n為稀釋倍數(shù)，b為標準曲線截距。

蛋白質(zhì)濃度的測定參照Lowry等［14］的方法，以牛血清白蛋白作為標準蛋白。

1.5 SDS－PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)及酶譜分析

SDS－PAGE參照Laemmli［15］的方法進行。分離膠為12.5%，濃縮膠為4.5%，考馬斯亮蘭R250染色顯示蛋白條帶。木聚糖酶酶譜參照楊紹青等［5］的方法。

1.6 實驗數(shù)據(jù)分析

每組實驗設置3個重復，實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理，結(jié)果取平均值并計算標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對菌株固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

分別采用玉米芯、玉米桿、稻草、高粱桿、玉米皮、麥麩、麥稈和甘蔗渣作為單一碳源進行菌株的固體發(fā)酵產(chǎn)酶實驗，結(jié)果如圖1所示。當以麥麩作為單一碳源時嗜熱棉毛菌CAU44產(chǎn)木聚糖酶活力最高，達到2483U/g干基碳源，其次是玉米芯(1755U/g干基碳源)和麥稈(1687U/g干基碳源)，而以其它幾種農(nóng)業(yè)廢棄物作為碳源時，其所產(chǎn)木聚糖酶活力差別不大，均在1000U/g干基碳源左右。

圖1 不同碳源對嗜熱棉毛菌CAU44固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活力的影響Fig.1 Effect of carbon source on the xylanase production from Thermomyces lanuginosus CAU44 by solid－state fermentation

由于麥麩的使用成本比其它幾種農(nóng)業(yè)廢棄物纖維質(zhì)原料高，因此為了進一步降低發(fā)酵產(chǎn)酶的生產(chǎn)成本，選用產(chǎn)酶量相對較高而成本較低的玉米芯與麩皮進行混合碳源發(fā)酵。結(jié)果表明在麩皮中適當添加玉米芯有利于菌株的產(chǎn)酶(圖2)，其產(chǎn)酶量與單一碳源相比都有明顯提高，當玉米芯與麥麩的比例為4∶6時，酶活力最高，達到11683U/g干基碳源，繼續(xù)增加玉米芯的含量，菌株產(chǎn)酶量出現(xiàn)大幅降低。

圖2 復合碳源配比對嗜熱棉毛菌CAU44固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活力的影響Fig.2 Effect of the ratio of corncob to wheat bran on the xylanase production from Thermomyces lanuginosus CAU44 by solid－state fermentation

同時還考察了碳源粒度對菌株產(chǎn)酶的影響(結(jié)果未列出)，實驗表明當復合碳源粒度較大時(0.9～2mm)，菌株產(chǎn)酶量在所有實驗組中最高，達到了13833U/g干基碳源，隨著碳源粒度的減小，菌株產(chǎn)酶量呈現(xiàn)下降的趨勢，當碳源粒度小于0.18mm時，酶活力與最高值相比下降了67%。

2.2 氮源對菌株固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

在最佳的復合碳源基礎上(玉米芯∶麥麩=4∶6)，添加不同氮源(添加量均為0.21g/L的有效氮)考察氮源對嗜熱棉毛菌CAU44產(chǎn)木聚糖酶的影響。實驗結(jié)果如表1所示，不同氮源對菌株產(chǎn)酶影響不大，但以(NH4)2SO4作為氮源時酶活力最高，達到13794U/g干基碳源。接著考察了(NH4)2SO4添加量對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果(未列出)表明隨著(NH4)2SO4添加量的增加，菌株產(chǎn)木聚糖酶的量不斷增加，當添加量為1.5g/L時，酶活力達到最高值15452U/g干基碳源。繼續(xù)增加(NH4)2SO4的量時，木聚糖酶活力反而開始下降。

表1 不同氮源對嗜熱棉毛菌CAU44固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活力的影響Table 1 Effect of nitrogen source on the xylanase production from Thermomyces lanuginosus CAU44 by solid－state fermentation

2.3 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH對菌株固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

不同溫度下發(fā)酵培養(yǎng)嗜熱棉毛菌CAU44以考察溫度對其產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3所示。當發(fā)酵溫度為50℃時菌株產(chǎn)酶量最高，達到15564U/g干基碳源。當培養(yǎng)溫度降低到45℃時，酶活力明顯下降，為最高酶活力的80%左右，當溫度進一步降低到40℃以下或升高到55℃以上時，產(chǎn)酶量出現(xiàn)了顯著的降低，55℃和40℃培養(yǎng)時產(chǎn)酶量僅分別為最高酶活力的29.4%和40.2%。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對嗜熱棉毛菌CAU44固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on the xylanase production from Thermomyces lanuginosus CAU44 by solid－state fermentation

將固體發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至不同的pH進行發(fā)酵，以考察初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響。實驗結(jié)果(圖4)表明，當初始pH為4.0時，菌株產(chǎn)酶量最高，達到15580U/g干基碳源。初始pH降低至3.0或升至7.0時，菌株產(chǎn)酶量變化不大，分別為最高值的96.2%和99.1%，而當初始pH繼續(xù)升高時，酶活力逐漸降低，當pH升高至8.0時，嗜熱棉毛菌CAU44產(chǎn)酶量僅為最高值的44.4%。

圖4 不同初始pH對嗜熱棉毛菌CAU44產(chǎn)木聚糖酶活力的影響Fig.4 Effect of initial pH on the xylanase production from Thermomyces lanuginosus CAU44 by solid－state fermentation

2.4 培養(yǎng)基含水量和表面活性劑對菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響

實驗中分別采用不同的料水比來考察水分含量對產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明，當料水比為1∶4時，菌株產(chǎn)酶量最大，酶活力達到15752U/g干基碳源，增加或減少水分含量，菌株產(chǎn)酶量都顯著降低(結(jié)果未列出)。

在上述最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎上添加不同的表面活性劑，考察表面活性劑對嗜熱棉毛菌CAU44固體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明(表2)，添加Tween－60可提高木聚糖酶的酶活力，與對照比較酶活力提高了11%，其它Tween系列表面活性劑對木聚糖酶活力影響不大，而Triton系列表面活性劑則對木聚糖酶的分泌有顯著的抑制作用，添加 Triton－100和Triton－114時酶活力分別下降了58%和64%。確定了最佳表面活性劑后接著研究表面活性劑的添加量對嗜熱棉毛菌CAU44固體發(fā)酵的影響。實驗結(jié)果表明，添加0.5%的Tween－60對木聚糖酶的產(chǎn)量促進最為明顯，酶活力最高達到17368U/g干基碳源。當繼續(xù)增加Tween－60的濃度時酶活力反而逐漸降低(結(jié)果未列出)。

表2 不同表面活性種類對嗜熱棉毛菌CAU44固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活力的影響Table 2 Effect of surfactant on the xylanase production from Thermomyces lanuginosus CAU44 by solid－state fermentation

2.5 培養(yǎng)時間對菌株固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

確定各發(fā)酵條件的最優(yōu)參數(shù)后，在最佳條件的基礎上考察發(fā)酵時間對嗜熱棉毛菌CAU44固體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。結(jié)果如圖5所示，菌株在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下，從第5d開始產(chǎn)酶速度加快，到第7d時酶活力達到最高值20343U/g干基碳源，然后酶活力趨于平緩略有下降。

圖5 培養(yǎng)時間對嗜熱棉毛菌CAU44產(chǎn)木聚糖酶活力的影響Fig.5 Effect of culture time on the xylanase production from Thermomyces lanuginosus CAU44 by solid－state fermentation

2.6 木聚糖酶電泳及酶譜分析

在最佳固體發(fā)酵產(chǎn)酶條件下培養(yǎng)嗜熱棉毛菌7d，采用SDS－PAGE及原位酶譜法檢測菌株分泌到胞外的蛋白組成及木聚糖酶情況，結(jié)果如圖6所示。嗜熱棉毛菌CAU44分泌到胞外的蛋白的條帶很少，主要為一種單一蛋白，占胞外蛋白總含量的80%以上(圖6，泳道1)。進一步采用原位酶譜法對木聚糖酶所處位置進行鑒定，結(jié)果顯示木聚糖酶譜帶在電泳膠上的遷移率與胞外主要蛋白遷移率一致(圖6，泳道2)，說明該主要胞外蛋白即為木聚糖酶。采用不同低分子量標準蛋白的遷移率與蛋白分子量的對數(shù)值作標準曲線，將木聚糖酶的遷移率代入到曲線中，計算出該木聚糖酶的分子量為25.6ku。

圖6 嗜熱棉毛菌CAU44固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶SDS－PAGE及酶譜圖分析Fig.6 SDS－PAGE and zymogram analysis of xylanase from Thermomyces lanuginosus CAU44 by solid－state fermentation

3 討論

3.1 發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響

嗜熱棉毛菌是產(chǎn)木聚糖酶的優(yōu)良菌種之一，迄今已經(jīng)分離得到數(shù)十種嗜熱棉毛菌。通過對菌株固體發(fā)酵產(chǎn)酶條件的研究，表明嗜熱棉毛菌CAU44能夠以農(nóng)業(yè)廢棄物作為碳源固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶。本研究發(fā)現(xiàn)以麥麩作為單一碳源時誘導嗜熱棉毛菌CAU44具有很好的效果，這與李秀婷等［6］研究結(jié)論一致。這可能是由于麩皮中富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等常用的培養(yǎng)基成分，既是碳源，又可作為氮源，同時還含有某些能對微生物生長和產(chǎn)酶起促進作用的生長因子。在麥麩中添加適量玉米芯可以改善固體培養(yǎng)基的通氣和散熱性能，有利于菌絲的生長和木聚糖酶的合成。實驗發(fā)現(xiàn)當玉米芯與麥麩以4∶6混合作為發(fā)酵碳源時，極大的提高了菌株產(chǎn)酶能力，是麥麩作為單一碳源誘導產(chǎn)酶量的4.7倍。這一結(jié)果與李秀婷等［6］實驗結(jié)果相似。另外，農(nóng)業(yè)廢棄物粒度的大小對菌株產(chǎn)酶也有顯著的影響，本研究表明較大粒度的碳源更有利于菌株產(chǎn)酶。Singh等［16］在研究菌株Thermomyces lanuginosus發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶時中也得到了相同的結(jié)論。碳源的粒度是影響菌株向胞外分泌酶的重要因素，較大的粒度可能有利于培養(yǎng)基質(zhì)的通氣與散熱，進而促進微生物的生長和酶的分泌。

氮源的類型和性質(zhì)也會影響酶的合成和分泌。本文發(fā)現(xiàn)以(NH4)2SO4作為氮源時菌株產(chǎn)酶量最高，這與周晨妍等［17］的研究結(jié)論一致。溫度對微生物產(chǎn)酶具有重要的影響，實驗結(jié)果表明嗜熱棉毛菌CAU44在50℃發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活力最高，培養(yǎng)溫度過高或過低，均會影響微生物產(chǎn)酶能力，這與李秀婷等［6］研究結(jié)果一致。本文還發(fā)現(xiàn)初始pH對嗜熱棉毛菌CAU44木聚糖酶的合成有顯著的影響，在中性或偏酸性環(huán)境下，嗜熱棉毛菌能夠較好利用農(nóng)業(yè)廢棄物合成和分泌木聚糖酶，而初始pH高于7.0，產(chǎn)酶能力大幅下降，這可能是由于初始pH高于7.0時，基礎營養(yǎng)液開始絮凝不利于菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收造成的。

在固體發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基初始水分含量是影響發(fā)酵產(chǎn)酶的關鍵性因素之一。當水分活度為80%時，嗜熱棉毛菌CAU44固體發(fā)酵木聚糖酶活力最高，增加或減少水分含量，菌株產(chǎn)酶量都顯著降低。這可能是由于含水量過低時，孢子萌發(fā)遲滯期延長，影響菌絲體的生長周期，同時降低了固態(tài)底物中營養(yǎng)物質(zhì)的溶解性和微生物生長所需要的水分活度，從而導致產(chǎn)酶量較低;而當含水量過高時，培養(yǎng)基表面粘連，造成培養(yǎng)基溶氧量不足，導致發(fā)酵不徹底，培養(yǎng)基利用率下降，從而影響到木聚糖酶的分泌量。因此，適當調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始水分含量對菌株的生長至關重要，也是木聚糖酶合成的關鍵因素之一。這一結(jié)果與Kalogeris等［18］在研究嗜熱子囊菌固體發(fā)酵產(chǎn)酶時的結(jié)論比較相近(該菌在料水比為1∶4和1∶5時產(chǎn)酶量最高)。研究發(fā)現(xiàn)添加 0.5% 的Tween－60可以提高木聚糖酶產(chǎn)量，這說明一定濃度的表面活性劑可以改善真菌細胞膜的通透性，使合成的酶更多地從胞內(nèi)釋放出來，從而提高胞外酶的產(chǎn)量。但繼續(xù)增加Tween－60的濃度酶活力反而會下降，這可能是由于高濃度的表面活性劑造成了細胞膜的解體，膜透性增大，使細胞內(nèi)的電解質(zhì)大量外滲，從而導致各種代謝失調(diào)引起抑制作用。從產(chǎn)酶曲線(圖5)可以看出，發(fā)酵各階段菌株的木聚糖酶的合成與分泌量不均衡，發(fā)酵后期產(chǎn)酶速率明顯較快，可能是由于嗜熱棉毛菌CAU44在發(fā)酵前期剛開始生長，生物量少，導致酶分泌量少;到發(fā)酵后期菌絲生長快，生物量迅速增加，進而使酶的分泌速度加快。菌株在發(fā)酵過程中蛋白濃度變化情況與酶活力變化趨勢基本相似。

表3 部分嗜熱棉毛菌固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶情況Table 3 Xylanase production of partial thermophilic fungi

3.2 產(chǎn)酶水平比較

國際上已有許多類似的利用農(nóng)業(yè)廢棄物作為碳源發(fā)酵產(chǎn)酶的研究報道(表3)。Purkarthofer等［19］利用玉米芯作為碳源固體發(fā)酵嗜熱棉毛菌生產(chǎn)木聚糖酶酶活力達到20216U/g干基碳源，與本研究產(chǎn)量較為接近。Manimaran等［20］以甘蔗渣作為碳源對嗜熱棉毛菌固體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶進行了優(yōu)化，酶活力能達到19320U/g干基碳源。Sonia等［21］利用高粱稈為碳源，優(yōu)化了嗜熱棉毛菌固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件，在最佳培養(yǎng)條件下，產(chǎn)酶活力最高達到48000U/g干基碳源，這是目前世界范圍內(nèi)嗜熱棉毛菌固體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶產(chǎn)量的最高值。其它一些相近的研究報道中產(chǎn)酶量均不高，在1000～5000U/g干基碳源之間［3，22］。國內(nèi)關于嗜熱棉毛菌固體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的研究報道較少，僅見李秀婷等［6］對嗜熱棉毛菌進行了固體發(fā)酵條件的優(yōu)化，酶活力達到15023U/g干基碳源。本研究中優(yōu)化后的產(chǎn)酶水平為國內(nèi)最高值，在國際上也處于較高的水平。

嗜熱棉毛菌來源木聚糖酶分子量主要分布在23～29ku之間［16］。本研究報道的木聚糖酶分子量(25.6ku)與其它一些嗜熱棉毛菌來源的木聚糖酶分子量相近，如來源于Thermomyces lanuginosusTHKU－49的木聚糖酶(24.9ku)［10］。目前，影響木聚糖酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和應用的主要障礙是酶的產(chǎn)量和生產(chǎn)成本。本研究采用固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的產(chǎn)量達到目前國內(nèi)最高水平;同時，所產(chǎn)胞外蛋白主要為木聚糖酶，所含雜蛋白很少，這一特點使酶在精制過程中易于純化，可減少純化工序，降低酶的生產(chǎn)成本;此外，由于固體發(fā)酵采用的主要原料為纖維質(zhì)材料，不僅生產(chǎn)成本低，而且生產(chǎn)出來的木聚糖酶可直接作為飼料添加劑直接添加在飼料中而無需純化。因此，本研究的結(jié)果表明，采用嗜熱棉毛菌CAU44為發(fā)酵菌株，利用固體發(fā)酵方式生產(chǎn)木聚糖酶非常適合用于木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

4 結(jié)論

單因素優(yōu)化實驗結(jié)果表明嗜熱棉毛菌CAU44酶在最佳發(fā)酵條件下固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活力最高達到20343U/g干基碳源，為國內(nèi)報道的最高值。嗜熱棉毛菌CAU44能夠利用農(nóng)業(yè)廢棄物固體發(fā)酵高產(chǎn)木聚糖酶的特性，尤其為今后該酶的固體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。

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Optimization of xylanase production fromThermomyces lanuginosusCAU44 by solid－state fermentation

FAN Guang－sen1，YANG Shao－qing1，YAN Qiao－juan2，YAN Ye1，JIANG Zheng－qiang1，*
(1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;
2.College of Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

The single－factor tests were employed to evaluate the optimal fermentation conditions for xylanase production ofThermomyces lanuginosusCAU44 by solid－state fermentation using agricultural wastes as carbon source.The results showed that the optimum conditions for xylanase production were as follows:mixture of corncob and wheat bran as carbon source(4∶6)，1.5g/L(NH4)2SO4as nitrogen source，the ratio of solid substrate to mineral solution ratio was 1∶4，the initial pH was 4.0，Tween－60 addition was 0.5%，and incubation temperature was 50℃.Under optimized conditions，the highest enzyme activity of 20343U/g dry carbon source was obtained at 7d，which was the highest value ever reported in domestic.Thus，xylanase production byThermomyces lanuginosusCAU44 processed a potential application from the industrial point of view due to the high level of xylanase production and low producing cost.

Thermomyces lanuginosus;xylanase;solid－state fermentation;agricultural wastes

TS201.3

A

1002－0306(2012)06－0219－06

2011－06－22 *通訊聯(lián)系人

范光森(1984－)，男，博士研究生，主要從事酶工程方面的研究。

863計劃課題(2011AA100905);新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(NCET－08－0534)。