實時熒光定量RT-PCR監測沙門氏菌活菌

張 沖，劉 祥，陳計巒

(1.石河子大學食品學院，新疆石河子 832000;

2.國家加工食品質量監督檢驗中心，天津 300384)

實時熒光定量RT-PCR監測沙門氏菌活菌

張 沖1，劉 祥2，*，陳計巒1

(1.石河子大學食品學院，新疆石河子 832000;

2.國家加工食品質量監督檢驗中心，天津 300384)

沙門氏菌是引起食物中毒的最常見致病菌，而基于DNA水平的常規PCR(DNA－PCR)檢測法雖然快速、靈敏，但在檢測時無法區分死活菌，死亡的細菌會出現假陽性結果，嚴重影響日常檢測結果的判斷。提取沙門氏菌總RNA之后，采用一步法逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT－PCR)，以沙門氏菌invA mRNA為檢測對象，發現只有活的沙門氏菌顯陽性，死亡的沙門氏菌呈陰性。而且RT－PCR法的穩定性良好，能夠準確定量活的沙門氏菌，在純培養時，檢出限可達1CFU/3mL。實驗表明，建立的RT－PCR法是一種能夠快速、精確檢測沙門氏菌活菌的方法。

沙門氏菌，RT－PCR，死活菌，常規PCR

沙門氏菌是食品中最常見的致病菌，大量存在于牛肉、豬肉、雞蛋、牛奶、海鮮等多種食物中，能引發多種沙門氏疾病，中、輕度感染會有腹瀉、嘔吐、腹部絞痛、發燒等癥狀產生［1］。在歐盟委員會、美、英、法、日等多個國際權威機構和國家發布的食品微生物限量標準中，對肉、蛋、奶類等動物性產品沙門氏菌的規定均為不得檢出，在所有微生物限量的標準中限制最為嚴格［2］。傳統培養檢測法，操作復雜繁瑣、耗時費力，完成整個檢測過程至少需要5d的時間［3］;而目前在食品微生物檢測中廣泛運用的定量PCR技術，大多是基于DNA水平的(DNA－PCR)，雖然快速、特異性強、靈敏度高，但由于細菌死亡后，DNA降解緩慢，能夠穩定存在，容易產生假陽性結果［4］。與DNA相比，mRNA的穩定性較差，在細菌死亡后能夠快速降解;而在細菌還具有活性時，就會產生mRNA［5］。研究顯示，選擇適當的mRNA作為靶點基因，運用RT－PCR技術，便能夠只檢測到具有活性的細菌，避免死亡細菌假陽性的出現［6］;invA mRNA在活的沙門氏菌中大量存在，在LB(Luria－Bertani)培養基中生長時，在其整個生長曲線中均能被檢測到;同時，invA mRNA是沙門氏菌入侵哺乳動物活細胞，表達毒理蛋白的必備基因，所有致病性沙門氏菌中均含有invA基因［5］。因此，invA mRNA是非常適宜于RT－PCR檢測沙門氏菌的靶點基因［7］。由此，本研究針對沙門氏菌invA基因設計TaqMan探針和引物，采用RT－PCR技術，擬建立一種快速、準確檢測沙門氏菌活菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙門氏菌salmonella(0246項目) 1株，上海之江生物科技;RNAprep pure 培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒，北京天根生化公司;PCR反應試劑，Salmonella Real Time PCR Kit 上海之江生物科技; DNase I、RNase－free 美國Fermentas公司;以上試劑

均為分析純試劑。

Bio－Rad PCR儀 配有 CFX96TMReal－Time System與C1000TMThermal Cycler，美國Bio－Rad公司。

1.2 引物與探針

設計依據:國標 SN/T1870－2007;合成廠家: Invitrogen;菌種名稱:沙門氏菌;目標基因:invA;引物序列:YF－SMFY－1:5'－GCGGCGTTGGAGAGTGATA－3'、YF－SMFY－2:5'－AGCAATGGAAAAAGC AGGATG－3';探針序列:YF－SMFY－3:5'－CATTTCTTAAA CGGCGGTGTCTTTCCCT－3'。

1.3 實驗方法

1.3.1 沙門氏菌培養 將活化后的菌液50μL接種于3mL LB培養液中，震蕩培養3h，200r/min，37℃。

1.3.2 DNA與RNA提取 分別按提取試劑盒說明書進行。

1.3.3 DNase I消化 按DNase I說明書進行。

1.3.4 一步法RT－PCR擴增體系 擴增體系共40μL，其中包括10×Buffer 4μL，MgCl23.2μL，dNTP 0.8μL，YF－SMFY－1 0.5μL，YF－SMFY－2 0.5μL，YFSMFY－3 0.3μL，混合酶1μL，ddH2O 25.7μL，RNA提取液4μL。

擴增參數為:45℃ ×10min;95℃ ×15min;94℃ × 20s，60℃ ×20s，72℃ ×20s，40cycles;單點熒光在72℃;選用FAM通道檢測。

1.3.5 DNA－PCR擴增體系 擴增體系共40μL，沙門氏菌熒光定量檢測混合液35.6μL，Taq酶0.4μL，DNA提取液4μL。

擴增參數為:94℃ ×2min;93℃ ×15s，60℃ × 60s，40cycles;單點熒光在60℃;選用FAM通道檢測。

1.3.6 區分死活菌 吸取兩管100μL活化后的沙門氏菌液，一管設為活菌，不做任何處理;另一管設為死菌，采用食品常用的巴氏滅菌方法(65℃水浴30min)滅菌。提取后，采用一步法RT－PCR檢測。

同時另取兩管相同濃度的死、活菌直接提取DNA，然后采用常規熒光PCR(DNA－PCR)的方法檢測。

比較兩組擴增結果，若DNA－PCR擴增后活菌與死菌均為陽性，而RT－PCR擴增后活菌結果為陽性，死菌為陰性，則說明能夠區分死活菌。

1.3.7 標準曲線制作 取1mL活化后的沙門氏菌，然后按步驟提取RNA，將提取液等比稀釋:100、10－1，10－2、10－3、10－4、10－5、10－6，再進行 RT－PCR擴增繪制標準曲線，并將定量結果與傳統培養法比對。

1.3.8 重復性 取不同體積的菌液進行RNA抽提，然后采用RT－PCR擴增，觀察RT－PCR體系的重復性效果，每個體積重復6次。

1.3.9 檢出限 在3mL培養基中分別加入菌量1、10、100CFU，37℃，200r/min，增菌3h后，RT－PCR擴增，觀察其擴增曲線。

2 結果與分析

2.1 區分死活菌

活菌與死菌在經過不同方式擴增后，結果見圖1。由圖1(A)顯示，DNA－PCR的擴增曲線死菌活菌均出現峰值;從圖1(B)可以看出，經過RT－PCR擴增后，活菌擴增曲線出現峰值，死菌的擴增曲線未出現峰值。數據顯示，經RT－PCR擴增后，活菌的Ct值為28.81，呈陽性，死菌未檢出，為陰性;而另一組經DNA－PCR擴增后，活菌的 Ct值為15.13，死菌為15.22，兩者均呈陽性。由此可以說明，RT－PCR具有區分死、活細菌的能力，能夠避免死菌假陽性的出現。

圖1 活菌與死菌擴增曲線圖Fig.1 Live and dead bacteria amplification curve

2.2 標準曲線繪制

將制備的等比稀釋樣品，采用本文所建立的實時熒光定量RT－PCR進行擴增，結果濃度在4×107～4×103CFU/mL的樣品可以形成較為理想的曲線(圖2(A))。以Ct值為縱坐標，對數濃度為橫坐標，繪制標準曲線(圖2(B))。經驗證，RT－PCR與培養法對活菌的定量吻合率為100%。

圖2 沙門氏菌標準曲線Fig.2 Standard curve of Salmonella

2.3 重復性

取不同體積的菌液，提取RNA后，經重復性擴增，結果見表1，由此可以看出該方法具有良好的重復性。

表1 RT－PCR擴增Ct值Table 1 RT－PCR amplification Ct value

2.4 檢出限

增菌3h后，1、10、100CFU的沙門氏菌經 RTPCR擴增后，均呈陽性。因此，在純培養時，增菌3h后的最低檢出限為1CFU/3mL。

圖3 RT－PCR檢出限擴增曲線Fig.3 RT－PCR amplification curves of the detection limit

3 討論

3.1 RNA的提取

高質量的RNA提取是后續RT－PCR檢測的關鍵步驟［8］，RT－PCR對RNA制品的要求極為嚴格，作為模板的 RNA分子必須是完整的，并且不含有DNA、蛋白質和其他雜質的高質量 RNA。細菌的RNA具有含量少，半衰期短，容易降解等特點，所以與動、植物等真核生物相比較，從細菌中提取、純化出高質量的RNA具有一定的難度［9－10］。

在不同的生長時期，沙門氏活菌中invA mRNA的含量是不同的。在生長指數中期、指數晚期以及平臺期時，invA mRNA的含量分別為 0.4、1、0.004copies/CFU［5］。因此，在提取RNA時，應選擇處于生長指數期的沙門氏菌。

生長環境是影響沙門氏菌mRNA表達的重要因素。在實際食品中，存在一些抑制沙門氏菌生長的因素，會使其活性降低，mRNA的數量減少，不利于RT－PCR對活細胞的檢測。通過前增菌，不僅可以使沙門氏菌數量增加，而且前增菌也是invA mRNA重新表達的過程［5］。因此，前增菌是RNA提取前必不可少的一步。

3.2 DNase I的使用

由于細菌死亡后，DNA仍然能夠穩定存在，且含量遠高于靶點mRNA的含量，會嚴重影響實驗結果，所以去除RNA提取液中的殘留DNA，是避免死菌假陽性出現的關鍵。研究表明，現有的DNase I難以一次完全消化掉殘留的DNA，但在經過兩次DNase I消化后，足以去除所有的殘留DNA［8］。但在確認是否有必要再次使用DNase I時，需根據實驗結果而定。因為隨著消化次數的增加，體系中的RNA也會出現一定的降解。已有研究顯示，Ct值相差在3.1～3.6時，同一體系中，其濃度大約有10倍左右的差異。因此，就本實驗而言，在經RT－PCR擴增后，活菌與死菌的Ct值相差大于4時，可認為兩者的Ct值存在差異，需再次使用DNase I消化提取液［5］。若活菌仍然為陽性，死菌為陰性，則說明區分死活菌實驗成功。如圖4(A)所示，經DNA－PCR檢測，活菌與死菌均為陽性，Ct值分別為15.58、16.00。而消化后經RT－PCR擴增，活菌與死菌仍均為陽性，但活菌的Ct值(22.96)小于死菌的Ct值(35.22)，且兩者的差值為12.26，見圖4(B)。因此，再次使用DNase I消化提取液，經RT－PCR擴增后，結果如圖4(C)所示，活菌的Ct值為30.49，死菌未檢出，呈陰性。

3.3 滅菌條件

mRNA的半衰期為0.5～50min［6］，在細菌死亡后，mRNA也具有一定的穩定性，能夠存在一定的時間，但這與滅菌方式以及滅菌后的存儲溫度有極大的關系［8］。因此，要充分降解死菌體內的mRNA，滅菌方式以及滅菌后的存放溫度選擇顯得尤為重要。有研究指出［4－8，10－11］，121℃滅菌15min;100℃滅菌10min，再室溫放置50min;80℃滅菌10min，再室溫或4℃放置1h;50%的乙醇溶液處理后，室溫放置6h或4℃放置72h等均能有效降解細菌體內的靶點mRNA。但這些滅菌方式并不適用于實際食品中沙門氏菌的檢測，因為這些方法在滅菌的同時會破壞食品物質的本身結構以及原有風味，所以本實驗選用食品中常用的巴氏滅菌方式(65℃水浴30min)，這樣不僅能充分降解細菌體內的invA mRNA基因［12］，而且能夠保證食品的原有風味，具有重要的實際意義。

圖4 活菌與死菌擴增曲線Fig.4 Live and dead bacteria amplification curve

雖然，目前RT－PCR技術在區分死活細菌上還存在著一定的爭議［10，13－14］，但是隨著研究的深入，RT－PCR技術會日趨完善。目前已有文獻表明，RT－PCR法不但能夠檢測到活性較強的細菌，而且還能夠檢測到處于活的非培養狀態(VBNC)下的細菌，具有較強的區分死、活細菌的能力，其檢測結果可作為菌體活性評估的重要參照［15］，這是其它快速檢測技術以及傳統檢測技術均無法比擬的優勢，因而有著不可估量的發展前景。

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Real－time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction detection of live Salmonella

ZHANG Chong1，LIU Xiang2，*，CHEN Ji－luan1
(1.College of Food Science and Engineering，Shihezi University，Shihezi 832000，China;
2.National Quality Supervision and Inspection Center of Processed Foods，Tianjin 300384，China)

Salmonella was the most common pathogens that cause food poisoning.The conventional DNA－based PCR(DNA－PCR)detection method was rapid and sensitive，but dead bacteria could not be distinguished from the viable in the detection method，and the death may cause false－positive results.That could seriously affect the daily test results.Total RNA was extracted from Salmonella，by applying one－step reverse transcription polymerase chain reaction(RT－PCR)，to detect Salmonella invA mRNA，only live Salmonella was found positive and death was negative.And the RT－PCR had good stability，it could quickly and accurately quantify the live Salmonella，the detection limit was 1CFU/3mL in pure culture.Experiments showed that the RT－PCR was a fast，accurate method to detect live Salmonella.

Salmonella;RT－PCR;dead and live bacteria;conventional PCR

TS207.3

A

1002－0306(2012)06－0091－04

2011－05－23 *通訊聯系人

張沖(1988－)，男，碩士研究生，主要從事食品科學與分子生物學研究。

國家質檢總局科技項目(2010QK307)，天津市質監局科技項目(10－11)。