改良的FOLIN-CIOCALTEU比色法測定核桃外果皮中總多黔含量

徐 佳，辛立方，張瑞廷，王華斌，傅 力

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052;

2.韓山師范學院生物系，廣東潮州 521041)

改良的FOLIN-CIOCALTEU比色法測定核桃外果皮中總多黔含量

徐 佳1，辛立方1，張瑞廷1，王華斌1，傅 力2，*

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052;

2.韓山師范學院生物系，廣東潮州 521041)

目的:建立核桃外果皮中總多酚含量的比色測定方法。方法:以沒食子酸為對照品，對測定核桃外果皮中總多酚含量的比色條件，包括檢測波長、碳酸鈉溶液用量、Folin－Ciocalteu試劑用量、反應溫度及時間對吸光值的影響進行了研究。結果:對照品標準曲線在1～7μg/mL范圍內為y=0.1031x+0.0793，R2=0.9996，線性關系良好，測定方法為采用核桃外果皮中總多酚提取液1.0mL，Folin－Ciocalteu試劑1.0mL、15%的碳酸鈉溶液4.0mL、30℃顯色1.5h，平均回收率為100.2%(RSD=0.91%)。此條件下測得核桃外果皮中總多酚含量為3.306mg/g。結論:該方法簡便快速、結果準確、重現性和穩定性好，可用于核桃外果皮中總多酚含量的測定。

核桃外果皮，總多酚，含量測定，比色條件

核桃外果皮又稱青龍衣，核桃外果皮中含有胡桃醌、α－氫化胡桃醌－4－葡萄糖苷、VC、鞣質、沒食子酸、胡桃醌生物堿和萘醌等［1］。近年來大量的研究表明，多酚類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抑菌、抗氧化等作用而被廣泛利用。測定多酚含量的比色法有高錳酸鉀法［2］，酒石酸亞鐵法［3］，普魯士蘭法［4］等，但是高錳酸鉀法具有誤差大、操作繁瑣等缺點，酒石酸亞鐵法對測定兒茶素類物質具有專屬性，普魯士蘭法在測定多酚時具有數據不穩定、誤差大等缺點［5］，而Folin－Ciocalteu比色法是植物多酚類化合物常用的測定方法，具有成本低廉、操作簡便易行、準確度和精密度高等優點。目前關于石榴皮［6］、獼猴桃［7］、桑葚［8］等多酚測定條件的研究較多，而關于研究核桃外果皮總多酚含量測定條件的文獻很少，通過查閱相關文獻，發現比色法測定核桃外果皮多酚的方法目前只有萬政敏［9］用普魯士藍法對核桃外果皮進行測定，未見有其他比色法的報道。由于植物多酚是一類混合物，所以不同來源的植物多酚在比色法測定上條件也有所不同［10－12］，需對其測定方法進行完善。本實驗以核桃外果皮為原料，對碳酸鈉、Folin－Ciocalteu試劑用量及顯色溫度，顯色時間進行優化，建立核桃外果皮中總多酚含量測定方法，為核桃外果皮的綜合開發利用研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃外果皮 2010年9月收于新疆阿克蘇烏什縣，陰干粉碎，過60目篩，將其放入棕色廣口瓶中保存備用;沒食子酸對照品 天津市光復精細化工研究所;Folin－Ciocalteu試劑 Sigma公司;無水碳酸鈉，無水乙醇 均為分析純。

TU－1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠;SHB－3循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;RE－85C旋轉蒸發儀 上海青浦滬西儀器廠;電子天平 梅特勒－托利多儀器有限公司;KQ－100B型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品液及標準液的配制 稱取5g核桃外果皮粗粉(60目)，加入80mL 80%乙醇采用超聲輔助提取法提取三次，超聲功率為100W，每次提取20min，合并三次提取液，過濾，減壓濃縮，再用80%乙醇定容至100mL，得到樣品液。

精確稱取0.025g沒食子酸標準品，用蒸餾水溶解并定容至1000mL，得到濃度為0.025mg/mL的標準液。

1.2.2 最佳測量波長的選擇［8］分別移取0.5mL標準液和樣品液，加入1.0mLFolin－Ciocalteu試劑及3.0mL質量分數為12%的Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至25mL，常溫靜置反應1h后，用紫外可見分光光度計在400～800nm波長范圍內掃描，確定最佳檢測波長。

1.2.3 比色體系各試劑用量的確定

1.2.3.1 Na2CO3溶液質量濃度的確定 取5份0.5mL標準液，加入1.0mLFolin－Ciocalteu試劑，在8min內加入4.0mL質量濃度為10%、12.5%、15%、17.5%、20%的Na2CO3溶液，蒸餾水定容至25mL，常溫反應1h，在最佳檢測波長處測量其吸光度，確定Na2CO3溶液的最佳質量濃度。

1.2.3.2 Na2CO3溶液用量的確定 選擇最佳質量濃度的Na2CO3溶液，用量分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，按照1.2.3.1方法，確定Na2CO3溶液的最佳用量。

1.2.3.3Folin－Ciocalteu試劑用量的確定 取6份0.5mL標準液，分別加入0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mLFolin－Ciocalteu試劑，按照1.2.3.1方法，確定Folin－Ciocalteu試劑的最佳用量。

1.2.3.4 反應溫度的確定 選擇反應溫度為20、30、40、50、60℃，按照1.2.3.1方法，確定最佳反應溫度。

1.2.3.5 顯色時間的確定 選擇顯色時間為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0h，按照1.2.3.1方法，確定最佳顯色時間。

1.2.4 標準曲線的建立 準確吸取沒食子酸標準液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，按照1.2.3中確定的最佳條件實驗，繪制標準曲線。

1.2.5 比色方法評價

1.2.5.1 精密度實驗 取1份1.0mL沒食子酸標準液，按照1.2.3中確定的最佳條件實驗，重復測定5次，計算結果的相對標準偏差，評價該方法的精密度。

1.2.5.2 穩定性實驗 取7份1.0mL樣品液，按照1.2.3中確定的最佳條件實驗，避光放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0h，計算結果的相對標準偏差，評價該方法的穩定性。

1.2.5.3 重復性實驗 取5份1.0mL樣品液，按照

1.2.3中確定的最佳條件實驗，計算結果的相對標準偏差，評價該方法的重復性。

1.2.5.4 加標回收實驗 取4份1.0mL樣品液，分別加入不同體積的沒食子酸標準液，按照1.2.3中確定的最佳條件實驗，計算沒食子酸的回收率和相對標準偏差。

1.2.5.5 核桃外果皮總多酚含量的測定 取1.0mL樣品液按照1.2.3中確定的最佳條件實驗，測定樣品液的吸光度，通過式(1)計算出樣品液中多酚的含量。

式中:M為核桃外果皮樣品液中總多酚的含量(mg/g);m為核桃外果皮樣品的質量(g);100為樣品液定容的體積(mL);25為測量時樣品液定容的體積(mL);y為吸光值。

2 結果與討論

2.1 最佳吸收波長的選擇

結果見圖1，在波長為697nm處有最大吸收峰，故選擇697nm為最佳檢測波長。

圖1 標準和樣品溶液的波長掃描結果Fig.1 Scanning spectra of standard gallic acid solution and sample after reaction with Folin－Ciocalteu reagent

2.2 比色體系各試劑用量的確定

2.2.1 Na2CO3溶液質量濃度的確定 從圖2看出，溶液的吸光值隨著Na2CO3溶液質量濃度的增加而上升，當Na2CO3質量濃度為15%時，溶液吸光值達到最大，當Na2CO3質量濃度大于15%時，吸光值減小，因此選擇Na2CO3的質量濃度為15%。溫度對碳酸鈉的溶解度影響較大，而且高濃度的碳酸鈉較易析出晶體，影響測定分析，文獻中多采用低濃度的碳酸鈉溶液［13－14］。

2.2.2 Na2CO3溶液用量的確定 從圖3得出，隨著15%Na2CO3溶液用量的不斷增加，吸光值也增加，當達到4.0mL時，吸光值最大，大于4.0mL后，呈現下降的狀態，所以選擇15%Na2CO3溶液用量為4.0mL。Na2CO3溶液是Folin－Ciocalteu法測定多酚反應中的緩沖液，孫宏［15］等通過對分光光度法測定天然多酚類物質的研究表明，多酚類物質的顯色對Na2CO3溶液用量的依賴性較大。

圖2 碳酸鈉濃度對多酚含量測定的影響Fig.2 Effect of sodium carbonate concentration on the determination of polyphenol content

圖3 15%碳酸鈉用量對多酚含量測定的影響Fig.3 Effect of 15%of the sodium carbonate amount on the determination of polyphenol content

2.2.3Folin－Ciocalteu試劑用量的確定Folin－Ciocalteu試劑與多酚類物質結合，在堿性條件下呈現藍色，Folin－Ciocalteu試劑對反應顯色效果的影響如圖4所示。

圖4 Folin－Ciocalteu用量對多酚含量測定的影響Fig.4 Effect of Folin－Ciocalteu amount on the determination of polyphenol content

隨著Folin－Ciocalteu試劑用量的增加，溶液的吸光值也隨之增大，當Folin－Ciocalteu試劑用量為1.0mL時，吸光值達到最大，大于1.0mL時，吸光值呈現平穩趨勢，所以Folin－Ciocalteu試劑用量為1.0mL。

2.2.4 反應溫度的確定 從圖5結果可以看出，反應溫度在30℃時，吸光值最大，溫度過高時，多酚類物質容易氧化，吸光值呈現下降的趨勢，因此，最佳反應溫度為30℃。

2.2.5 顯色時間的確定 多酚類物質與顯色劑的反應需要一定的時間，當達到一定時間以后，由于部分多酚被氧化［16］，吸光值逐漸減小。從圖6結果可以看出，在1.5h時，吸光值最高，表明核桃外果皮中含有的多酚物質與顯色劑已經完全顯色，因此顯色時間選擇為1.5h。

圖5 反應溫度對多酚含量測定的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on the determination of polyphenol content

圖6 顯色時間對多酚含量測定的影響Fig.6 Effect of color time on the determination of polyphenol content

2.3 標準曲線的建立

以沒食子酸標準液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，結果如圖7所示。線性回歸得沒食子酸濃度(x)與吸光度(y)的關系:y=0.1031x+ 0.0793，R2=0.9996，線性關系良好。

圖7 核桃外果皮總多酚測定的標準曲線Fig.7 Standard curve of walnut husk polyphenol

2.4 方法評價

2.4.1 精密度實驗 按照1.2.3中確定的最佳條件實驗，重復測定沒食子酸標準液5次，計算結果見表1。相對標準偏差RSD為1.58%，表明該方法測得核桃外果皮總多酚的精密度較高。

表1 精密度實驗結果(n=5)Table 1 Result of precision test(n=5)

2.4.2 穩定性實驗 按照1.2.3中確定的最佳條件實驗，避光放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0h，計算結果見表2。相對標準偏差RSD為2.50%，能夠滿足樣品分析的要求。

表2 穩定性實驗結果(n=7)Table 2 Result of stability test(n=7)

2.4.3 重復性實驗 取5份1.0mL樣品液，按照1.2.3中確定的最佳條件實驗，計算結果見表3。相對標準偏差 RSD為1.86%，表明該方法重復性較好。

表3 重復性實驗結果(n=5)Table 3 Result of repetitive test(n=5)

2.4.4 加標回收實驗 結果如表4所示。平均加標回收率為100.2%，最高加標回收率為101.2%，最低為99.4%，RSD為0.91%，表明該方法具有較高的準確性和可靠性。

表4 回收率實驗Table 4 Recovery of experiment

2.4.5 核桃外果皮總多酚含量的測定結果 測定樣品的吸光度為0.761，根據式(1)，計算出樣品核桃外果皮多酚含量為3.306mg/g。

3 結論與討論

建立了測定核桃外果皮中總多酚含量的Folin－Ciocalteu比色法，本方法具有操作簡單，效率高、設備要求低、精密度高、穩定性和重復性好等優點，適用于核桃外果皮中總多酚的含量測定。

比色法中采用普魯士蘭法測定核桃外果皮中多酚類物質時數值不穩定，準確性差，而且生成的普魯士蘭對實驗器皿染色，難以清洗［5］，本實驗建立的方法避免了此類問題。

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Determination of total polyphenol in walnut husk with improved Folin－Ciocalteu colorimetry

XU Jia1，XIN Li－fang1，ZHANG Rui－ting1，WANG Hua－bin1，FU Li2，*
(1.College of Food Science and Pharmaceutical Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;
2.Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，China)

Objective:To set up an assay method for the determination of total polyphenol in walnut husk.Method:The determination conditions of total polyphenol content in walnut husk including the detection wavelength，the amount of sodium carbonate solution，Folin－Ciocalteu reagent，reaction temperature and time were studied and gallic acid was used as a standard.Results:The standard curve was linear in the range of 1～7μg/mL(y=0.1031x+0.0793，R2= 0.9996)and the optimum conditions for determining total polyphenol in walnut husk were as followed:1.0mL of the walnut husk extract polyphenol，1.0mL of Folin－Ciocalteu reagent dosage and 4.0mL of 15%sodium carbonate solution，treatment at 30℃for 1.5h，the average recovery was 100.2%(RSD=0.91%).Under these conditions，the total polyphenol content of walnut husk was 3.306mg/g.Conclusion:This method was simple and quick，the result was accurate，repeatable and stable.It can be used for the determination of total polyphenol content in walnut husk.

walnut husk;total polyphenol;determining content;colorimetric conditions

TS207.3

A

1002－0306(2012)06－0060－04

2011－05－03 *通訊聯系人

徐佳(1985－)，女，在讀碩士，研究方向:食品生物技術。

國家“十一五”科技支撐計劃項目(2007BAD36B04);新疆維吾爾自治區高效科研計劃科學研究重點項目(XJEDU2008I13)。