阿維A治療尋常性銀屑病療效與藥物遺傳學相關性研究

謝韶瓊，陳 敏，萬慶華，宋 勛，汪青良，張玲琳

銀屑病因其發病率高，發病原因不明，長期治療效果不理想，給患者身心健康帶來極大的痛苦[1]。臨床實踐發現，具有同一種疾病的不同患者對同一藥物的療效不一樣，而藥物效應的個體化差異常常導致經驗用藥的失敗，甚至出現嚴重的不良反應。阿維A是臨床上治療尋常性銀屑病的首選藥物[2,3]，但是，筆者在長期的臨床實踐中發現，同是尋常性銀屑病患者，采用同樣劑量的阿維A系統治療，臨床療效和患者的不良反應差異很大。國外已有學者對血管表皮生長因子（VEGF）與藥物遺傳學相關性進行了研究[4]。本研究擬采用藥物遺傳學研究方法，通過對患者基因單核苷酸多態性[VEGF-460(rs833061)，VEGF+405C(rs2010963)]的檢測分析，結合阿維A治療尋常性銀屑病的療效觀察，研究我國尋常性銀屑病患者系統用藥效應基因多態性的特點，探討其與銀屑病病情及系統藥物治療的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例選擇 選取2010年3月～2011年9月在上海市皮膚病醫院住院的尋常性斑塊狀銀屑病患者105例。①診斷標準：參照2002年國家藥品監督管理局組織制定的《中藥新藥臨床研究指導原則》[5]中尋常性銀屑病的西醫診斷標準。皮膚損害以紅色炎性丘疹、斑丘疹及大小不等的斑片為主，上覆多層銀白色鱗屑，刮去鱗屑可見一層光亮的薄膜，薄膜下可見點狀出血（Auspitz征）。②入選標準：符合尋常性銀屑病診斷標準，選擇斑塊狀銀屑病患者，年齡16～80歲；不符合排除標準任意一項；治療前3個月內未使用過維A酸、免疫抑制劑，未接受過光療、藥浴等治療；入選患者治療前銀屑病皮損面積嚴重度指數（PASI）評分10～12分；自愿參加本研究，能配合按期隨訪并簽署知情同意書者。③排除標準：并發嚴重的心、肝、肺、腎等內臟疾病及高血脂患者；妊娠期、哺乳期婦女；對本試驗藥物過敏者；治療期間隨意中止或更換治療藥物及方法者；關節性、膿皰性、紅皮病性銀屑病患者。

入選的105例患者中男79例，女26例，平均年齡（38.7±13. 9)歲，平均病程（6.5±3. 3)年。抽取每例患者的外周血4 ml備用。

1.1.2 主要儀器與試劑 PCR反應擴增儀（加拿大BBI公司）；3730測序列分析儀（美國 ABI 公司）；SW-CJ-1D潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設備廠）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）；DYY-8型穩壓穩流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司）；YXJ-2離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；H6-1微型電泳槽（上海精益有機玻璃制品儀器廠）；凝膠成像系統（Gene Genius公司）；移液器（范圍：100～1 000 ml，20～200 ml，0.5～ 10 ml）（加拿大 BBI公司）。TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer(不含 Mg2+，其主要成分：100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，25℃；500 mmol/L KCl，0.8%（v/v）Nonidet）；MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）、Marker、6×DNA Loading Dye（生工生物工程有限公司）；PCR產物純化回收試劑盒（生工生物工程有限公司，編號SK1141）；10×TAE（電泳緩沖液，成分：400 mmol/L Tris-acetate，10 mmol/L EDTA，pH8.0）。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提 不同基因型引物設計及PCR擴增：用上述酶和試劑抽提外周血DNA，-20 ℃保存備用。每例選用備選基因VEGF的2個位點（VEGF+405和VEGF-460），引物序列查自http://www.ncbi.nih.gov/unists，由上海生物工程有限公司合成，用應用軟件Primer Premier 5（表1）。50 ml反應體系中，第1輪模板1 ml，引物F 1 ml，引物R 1 ml，dNTP 10 mmol/L 1 ml，Taq Buffer 5 ml，25 mmol/L MgCl25 ml，Taq 酶0.5 ml，水35.5 ml；第2輪模板（第1輪PCR產物）0.2 ml，滅菌水36.3 ml，余同第1輪。PCR反應條件：預變性95 ℃，3 min；變性94 ℃，30 s ；退火58 ℃，30 s ；延伸72 ℃，45 s；修復延伸，5 min；循環25次。

表1 不同基因型引物序列

1.2.2 電泳 1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA、20 min電泳觀察。

圖1 基因rs833061序列圖

圖2 基因rs2010963序列圖

1.2.3 測序 PCR產物純化回收試劑盒（生工生物工程有限公司SK1141），F引物測序。檢測結果見圖1，圖2。

1.2.4 治療方法 給予每例患者阿維A 20～30 mg/d[0.4 mg/(kg·d)]，3個月后總結療效，治療前以及治療過程中每個月檢查肝、腎功能，血脂，血常規各1次。

1.2.5 療效評判 根據張長宋等[6]的方法改良。治療前、后分別對患者進行PASI評分，療效指數=（治療前PASI評分－治療后PASI評分）/ 治療前PASI評分×100%。痊愈：皮損全部消退，PAS1分值下降90%。顯效：皮損明顯消退，PAS1分值下降80%。有效：皮損部分消退，PAS1分值下降50%。無效：皮損消退不明顯，PAS1分值下降不足50%。

1.3 統計學方法

采用SPSS10.0軟件，率的比較采用卡方檢驗進行統計學分析。

2 結果

2.1 1%瓊脂糖電泳結果

基因rs833061和rs2010963擴增條帶的大小分別為271 bp和172 bp（圖3，4）。

圖3 擴增的rs833061條帶片段電泳圖，大小為271 bp

圖4 擴增的rs2010963條帶片段電泳圖，大小為172 bp

2.2 尋常性銀屑病患者VEGF基因型分布情況

105例尋常性銀屑病患者中，1例因丙氨酸轉氨酶偏高、1例因血脂過高、3例因皮膚黏膜干燥而退出本研究。每例選測2個位點（基因rs833061和基因rs2010963），其中基因rs833061C/C型10例（10%），rs833061T/T型 46例（46%），rs833061C/T型44例（44%）；基因rs2010963G/G型51例（51%），rs2010963C/G型33例（33%）, rs2010963C/C型16例（16%）（圖5）。

圖5 100例尋常性銀屑病患者VEGF基因型分布比例

2.3 阿維A治療不同基因型尋常性銀屑病患者的療效

治療前對不同基因型組的尋常性銀屑病患者進行PASI評分，經t檢驗各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。 基因rs833061C/T型尋常性銀屑病患者口服阿維A的有效率為 90.9%, rs833061C/C型患者有效率為70.0%，rs833061T/T型患者有效率為63.0%，基因rs833061C/T型患者的有效率與其他各型相比差異有統計學意義（P＜0.05）。基因rs2010963G/G型尋常性銀屑病患者口服阿維A有效率為70.6%,rs2010963C/G型患者有效率為69.7%, rs2010963C/C型患者有效率為68.7%，除rs833061C/T型外，其余各型之間的有效率相比差異無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 阿維A治療不同基因型尋常性銀屑病患者的療效對比 （例）

3 討論

阿維A是美國FDA批準治療銀屑病3種一線藥物（甲氨蝶呤、阿維A、環孢素）中最安全的一種，是目前治療銀屑病的首選藥物。藥物遺傳學研究證明，藥物效應基因多態性是確定不同患者產生不同療效和不良反應的基礎。近年來，人類基因組計劃的完成為該現象做出了解釋：人類基因存在著大量的單核苷酸多態位點，這是造成不同個體在相同環境中對疾病的易感性、對藥物的敏感性及不良反應不同的原因[7,8]。此前，研究較多的是某些基因與銀屑病發病及病情的相關性，或者阿維A對銀屑病患者VEGF的影響[9,10]。國外有研究證明，阿維A治療尋常性銀屑病的臨床療效與患者VEGF不同基因型有很大的相關性，確定VEGF多態性和每例患者VEGF的標志可以作為預測銀屑病治療反應的手段[4]，但是目前沒有系統的臨床和實驗研究。據此，本研究旨在通過對我國尋常性斑塊狀銀屑病患者血液VEGF多態性檢測，結合阿維A的療效，分析兩者的相關性，為今后臨床選藥、提高療效、減少藥物不良反應提供借鑒，為進一步的基因和藥物療效相關性研究奠定基礎。

隨著人類基因組計劃的完成和后基因組時代的到來，人們可以利用先進的分子生物學技術對不同個體的藥物相關基因進行解讀，臨床醫師可以根據患者的基因型資料實施給藥方案，并“量體裁衣”式地合理用藥，以提高療效和降低不良反應，同時減輕患者的病痛和經濟負擔。這種基因導向的個體化用藥，代表著藥物基因組學與臨床遺傳學的完美結合，具有劃時代的意義。

本研究結果顯示，100例尋常性斑塊狀銀屑病患者有不同的VEGF基因型，采用阿維A 0.4 mg/(kg·d)治療3個月后，基因rs833061C/T型患者的治療效果最好。希望今后通過類似的更大樣本研究得出科學結論，通過快速單核苷酸多肽檢測，為阿維A治療尋常性銀屑病提供選擇性借鑒，提高其臨床療效，減少不良反應。

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