一例疑似豬細小病毒感染流行的實驗室診斷

陳招娣，李潤成*，蔣大良，余興龍

（湖南農業大學動物醫學院，湖南長沙 410128）

豬細小病毒病是由豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)引起，以母豬特別是初產母豬繁殖障礙為特征的一種病毒性疾病。該病能導致母豬不孕、流產、產木乃伊胎、畸胎或死胎、新生仔豬死亡，還能導致仔豬皮炎、腹瀉等。

2011年4月，湖南某規模豬場飼養的160頭母豬中60頭初產母豬，陸續表現流產，產死胎，木乃伊胎等。筆者對該場的母豬抽樣采血并進行了豬瘟病毒抗體、藍耳病毒抗體以及偽狂犬的野毒抗體的檢測。此外還對流產死胎進行了豬細小病毒的病原學檢測。現報告如下：

1 材料

1.1 病料樣品

21 份母豬血液（1～10 號來自經產母豬、11～21號來自初產母豬），3頭懷孕70天以內流產的死胎。

1.2 主要試劑和試劑盒

檢測豬瘟病毒抗體、藍耳病毒抗體、偽狂犬野毒抗體的ELISA 試劑盒均為美國IDEXX 公司生產，PCR 試劑購自北京全式金生物技術有限公司，瓊脂糖凝膠為鼎國公司生產。

2 方法

2.1 血清抗體的檢測 按試劑盒操作說明進行。

2.2 細小病毒的PCR 檢測

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2.2.1 引物的設計和合成

參照GeneBank 上登陸的豬細小病毒基因序列(參考序列登陸號為EU790641)，設計一對引物，特異性擴增196bp 的DNA 片段。引物設計見表1。

2.2.2 PCR 檢測

取流產死胎的肝臟、肺臟，研磨成勻漿，按蛋白酶K、酚、氯仿的方法抽提，提取基因組后，用引物Fp1 和Rpl 進行PCR 擴增豬細小病毒特異性片段，PCR 反應程序為：94℃預變性5 min；進入循環，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30s，進行 35 個循環；72℃延伸7min。最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.2.3 PCR 產物測序

將PCR 產物用純化試劑盒進行清潔純化，純化后的PCR 擴增產物送北京華大生物技術有限公司進行測序并將測出的序列進行Blast 分析確定。

3 結果

3.1 血清抗體檢測結果

取21 份母豬血清分別進行豬瘟病毒抗體（HCV Ab）、藍耳病毒抗體（PRRSV Ab）、偽狂犬野毒抗體（PRV Ab）3 個項目的檢測。檢測結果見表2，由表2 可見21 份血清中有14 份為豬瘟抗體陽性，其中經產母豬的有7 份，初產母豬的有7 份；藍耳病毒抗體則所有樣本均為陽性，21 份樣本中S/P 值均在2.0 以下；所有血清樣品偽狂犬野毒抗體均為陰性。

表2 中，豬瘟抗體判定標準：阻斷率≥40%為陽性（+），阻斷率≤30%為陰性（-），30% ＜ 阻斷率＜40%為可疑（±）；藍耳病毒抗體判定標準：S/P值≥0.4 時為陽性（+），S/P 值 ＜0.4 時為陰性（-）；偽狂犬野毒抗體判定標準：被檢樣品S/N≤0.6 為抗體陽性（+）；S/N＞0.7 為抗體陰性（-）；0.6＜S/N≤0.7 為可疑（±）。

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3.2 PCR 檢測結果

以提取的豬細小病毒基因組為模板，用設計的豬細小病毒特異性引物進行PCR 擴增，結果見圖1，由圖可見3 份病料樣本均擴增出與預期大小相符的片段。

3.3 測序結果

PCR 產物純化后送公司進行1 個反應的測序，共得到196bp 的準確序列，進行BLAST 分析發現該病毒確為豬細小病毒，序列如下：

GGACCATTAACAGCACTAAACAATACTGCACCTG TATTTCCAAATGGTCAAATATGGGATAAAGAACT TGATACAGATCTAAAACCTAGACTACATGTTACA GCTCCATTTGTTTGTAAAAACAATCCACCAGGAC AACTATTTGTAAAAATAGCACCAAACCTAACAG ATGATTTCAATGCTGACTCTCCTCAAC

4 討論

4.1 疫情診斷

該母豬群豬瘟抗體陽性率66.67%，陰性率28.57%，可疑率4.76%；藍耳病毒抗體陽性率為100%，且抗體水平S/P 值均在0.4～2.0 之間；偽狂犬野毒抗體均為陰性。從檢測結果可見該母豬群豬瘟抗體水平不理想，但由于表現流產、產木乃伊胎的初產母豬有半數以上豬瘟抗體水平較好，抗體阻斷率值在60%以上，因此可以推斷該次疫情不是由豬瘟病毒引起，此外，母豬群藍耳病毒抗體均為陽性且抗體水平比較整齊，目前該豬場應該不屬于藍耳病毒感染活躍豬群；偽狂犬野毒抗體均為陰性，表明豬群中沒有偽狂犬野毒感染和流行。

取流產死胎進行豬細小病毒的PCR 檢測并測序，結果表明在樣本中均能檢測到細小病毒基因，結合臨床癥狀可將該場出現的初產母豬流產、產死胎、木乃伊胎確診為細小病毒感染造成。

4.2 豬場細小病毒病的防控

豬細小病毒病是導致母豬特別是初產母豬繁殖障礙的疾病之一，隨著規?；B殖的發展，母豬的健康和產仔率、仔豬成活率越來越成為養殖業的關鍵。筆者認為，對于豬細小病毒病的防控應做到以下幾點：一是引種要規范，杜絕引進病豬和帶毒豬；二是初產母豬要主動免疫后才能配種，后備公豬在配種前一個月應進行免疫接種；三是要建立規范、科學的免疫程序，定期進行血清學監測及時了解豬群免疫狀況；四是應建立高標準的衛生防疫和綜合防制措施，杜絕病毒的傳播和污染，促進豬場健康發展。 □