血凝和血凝抑制試驗常見問題及解決方法

蔡文杰 ，邱立新 ，邱美珍 ，杜麗飛

（1.湖南畜牧獸醫研究所，湖南長沙 410131;2.湖南省動物疫病預防控制中心，湖南長沙 410007)

1 前言

血凝試驗(H A)和血凝抑制試驗(HI)由于能同時進行大量樣本分析,試驗過程易于操作以及結果快速、準確等特點而成為目前我國各地疫病診斷、流行病學調查、免疫程序制定及免疫效果監測等的主要手段之一,與酶聯免疫吸附試驗(ELISA)具有同樣重要的作用。

近年來，經常在技能比武、獸醫實驗室考核和實驗室比對試驗中采用血凝和血凝抑制試驗方法檢測新城疫或禽流感抗體，試驗所需時間不長，涉及到的實驗因素在血清學試驗中有一定的代表性。同時該試驗具有可比較性和可重復性，試驗結果容易觀察和辨認，能客觀反映出實驗人員的水平和能力的優點。另外，由于近年來動物防疫工作的需要，各地廣泛采用這一方法評價免疫抗體水平，有的把試驗結果直接與目標管理考核和績效考評掛鉤，有時一個試驗結果的好壞就決定排名先后，甚至是年度工作績效和收入。因此，各地獸醫實驗室非常重視這一實驗。不僅國內如此，其他國家也經常在教學和實驗室技能比賽，比對試驗(包括人員之間比對、實驗室之間比對)等方面運用該試驗。然而，這一看似簡單的方法，如果不注意很可能不同的人做同一份血清，其結果有天壤之別。為了更好地掌握這項檢驗技術，現總結了一些經驗，供同行參考與交流。

2 緩沖體系的配制

根據新城疫和禽流感的相關國家標準[1～2]，H A、HI試驗的緩沖體系是0.01 Mp H7.2 PBS，保持整個試驗各步驟緩沖體系的一致性很重要，不論在洗雞紅細胞、配制1%雞紅細胞，還是在做H A試驗或HI試驗都應使用這種緩沖液。實驗室的緩沖液最好現配現用，高壓滅菌后使用，一般放置冷藏冰箱不超過1個月，當發現PBS中有絮狀沉淀物時不宜再用。配制PBS時要注意的是，如果按照上述標準文本中磷酸氫二鈉的用量是1.44 g/L，而我們常用的磷酸氫二鈉中含12個水分子，因此用量要換算增加。

一般情況下PBS配好后不需調p H值，配好后高壓滅菌，冷藏保存備用。若需要調則用1 N的N a O H調p H值到7.2。值得引起注意的是現在市面上買的p H試紙很多不準確，有條件的實驗室最好用酸度計測試已經購買的p H試紙。現在市面上也有小包裝的PBS粉購買，每包可配制1000 mL PBS溶液，使用非常方便。根據我國禽流感研究先驅唐秀英老師的經驗，禽流感試驗中包括瓊擴和H A、HI試驗，還是用略偏酸性的PBS較好（p H 6.8）。我們的經驗是在沒有PBS的情況下用復方氯化鈉注射液（林格氏液）也有類似效果。

3 血凝板或微量振蕩器的使用

采用一次性血凝板做實驗是最好的，尤其是在做比對試驗這種量小又是關鍵性的試驗時。目前市面上可重復使用的聚苯乙烯有機玻璃板購買時要注意底角是否為90度，底面是否光滑，清潔，如果不清潔，清洗后可用棉簽醮酒精把孔底擦干凈。有機玻璃血凝板的好處是可以疊放，在做大批量檢測試驗時節省空間。用過的微量血凝板應立即用高壓自來水把每個孔都沖洗干凈，甩干，倒扣溫箱中烘干以便下次使用。

微量振蕩器使用時應注意振動不宜過大，時間不能太長，一般振動10秒鐘即可。多塊板同時振動時要注意壓住上板，以防液體濺出而影響結果。

31%雞紅細胞懸液及抗凝劑

3.1 1%雞紅細胞懸液的配制

一般來說，使用3.8%的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑是比較簡單方便的。3.8 %檸檬酸鈉的配制：稱取3.8 g檸檬酸鈉置三角燒瓶中，加純水100 mL，15磅、15 min高壓滅菌，分裝到2 mL離心管中，凍存備用。

制作1%雞紅細胞時，取十分之一采血量的3.8%檸檬酸鈉溶液到一次性注射器中，健康公雞翅下靜脈采血后立即混勻，將抗凝血加到離心管中，用10倍以上血量的PBS洗滌3次（2000 r/min，每次離心5 min），抽干紅細胞泥上的上清液，采用紅細胞壓積的方法計算出配制1%雞紅細胞懸液的量。具體方法是用注射器抽取一定量PBS打散離心管底的紅細胞泥，然后抽回到注射器中，這兩種量的差就是紅細胞的量。如抽取3mLPBS打散紅細胞泥，抽回后得4mL，測得紅細胞為1mL，這樣可配制100mL1%雞紅細胞懸液。

3.2 配制經驗

采用紅細胞壓積方法常因各實驗室所用的離心機的轉子半徑有差異致離心力不同以及離心的速度不同，從而使紅細胞壓積量不同，也因紅細胞壓積時上清液沒有抽干，或在洗滌紅細胞棄去上清液時紅細胞流失，配制時出現較大的誤差，這是應該注意的。根據經驗每采1mL雞血可配成30 mL左右的1%雞紅細胞。如果超過了40 mL，則配制不準，如果超過的量更大，則實驗將受到極大影響。配制1%雞紅細胞懸液是整個實驗的關鍵之一，配準了，以后的實驗一般會比較順利。曾有某實驗室采10 mL雞血卻配制出了800 mL“1%雞紅細胞”，這樣的H A、HI實驗難以成功。

4 血凝試驗中常見問題

4.1 抗原配制

如果用凍干血凝抗原做H A、HI試驗，需要重懸凍干抗原（凍干血清也同樣）：按瓶簽要求的量加入滅菌注射用水，搖勻。最好提前重懸，凍存過夜，第2天解凍后使用，這樣做的效果會穩定一些。有的實驗室在重懸凍干抗原時用PBS或生理鹽水，這是不正確的，因為凍干品中原液的鹽分都留下來了，只需要加入注射用水或者滅菌純水就行了。

4.2 血凝效價測定

做血凝試驗是為了準確測量血凝效價，為配制四單位抗原和做血凝抑制試驗而準備。為準確測量出血凝價，一般要求做三排相同的試驗。有的為更加準確測量出血凝效價，也可以考慮將抗原三倍稀釋與二倍稀釋各做二排，二者結合起來計算出凝集終點（一單位抗原）的稀釋倍數。血凝試驗每孔液體總量為75 μL，抗原稀釋后各孔要補充PBS至50 μL后再加25 μL 1%雞紅細胞。加紅細胞時要注意防止“掛滴”現象的發生（紅細胞沒有全部加到孔中，而是有一部分掛在吸嘴尖上）。H A試驗結果判斷時要求將板傾斜45度，觀察沉集紅細胞流淌情況（圖1中C、D所示），凡是有流淌的都不能算成100%凝集。掌握100%紅細胞凝集作為血凝試驗的終點很重要，如果終點孔中心有點狀沉集，都對以后的試驗有較大的影響。紅細胞沒有充分打散或采血后血液與抗凝劑沒有充分混勻常出現這種情況。當紅細胞配制濃度偏低時，終點判定很容易出現錯誤，這也多是找不到實驗失敗原因的主要問題。為了準確判斷血凝終點、防止實驗失敗而重做，往往寧可嚴一點，也決不可放松判定，這也應該是有經驗的實驗員常常采取的策略。

4.3 血凝效價測定結果的有效時間

血凝試驗的結果往往只是當批次有效，如果下午（尤其是在夏天）或第2天接著做實驗的話就要重新測量血凝價了。血凝效價是與當時做H A試驗時的紅細胞懸液相配套的。如果換了一批紅細胞懸液，就必須重新測試血凝抗原的效價；同理，如果換了抗原也同樣需要重新測定。血凝試驗做完，四單位抗原配制好后，要把剩余的抗原（凍干重懸的原液）立即冷凍保存才不至于抗原效價有大的損失。血凝試驗一般在加雞紅細胞后不少于30 min看結果，冬季可適當延長至40 min，總之一定要待空白對照孔中液體清亮，才能讀結果。

5 血凝抑制試驗中常見問題

5.1 樣品血清

新鮮的樣品血清一般可以不需要滅活處理，然而有的送檢血清已經變質，最好經過56℃水浴30分鐘滅活處理，這樣做出來的結果才會一致。凍存樣品血清在解凍后出現分層的現象，搖勻才能用于檢測。

5.2 陰性血清

試劑提供商一般不提供陰性對照血清。可用8倍稀釋滅活的豬血清代替。

5.3 陽性血清

如果是凍干品按前述抗原稀釋的方法重懸，搖勻后用于實驗。

5.4 禽流感抗體檢測

做禽流感抗體檢測時，最好使用與被檢血清相同的紅細胞，如檢測水禽血清最好用鴨紅細胞。這樣可以省去處理樣品血清的麻煩。水禽血清在做HI試驗時常有非特異性凝集（前凝集）發生，如圖1所示。有的甚至可以達到5孔，給判定結果帶來不便。為去掉非特異性凝集，在不方便取水禽紅細胞時，常將血清進行處理。方法是：取5%～10%雞紅細胞與等量水禽血清混合30 min，取上清液做HI試驗。結果判定時要比原方法高一個滴度。

一般說來，只要1%雞紅細胞和四單位抗原配制準確，血凝抑制試驗只要按程序操作一般都會成功。在做大量樣品檢測時，常有將樣品只做8孔的情況，雖然可以查出陽性率或合格率，但高效價的血清測量不到頂。

5.5 抗原回滴的操作

抗原回滴（或稱為4單位抗原校正見圖2）是適時檢測四單位抗原配制是否準確的重要方法[3～4]。抗原回滴的操作一般是：在2排或3排孔中各加25μLPBS，在第1、2列孔中各加25 μL四單位抗原，從第2列孔向第4列孔作倍比稀釋，棄去最后25 μL，從第2列孔向最后一孔各補25 μL PBS，然后每孔各加25 μL 1%的雞紅細胞懸液。振蕩混勻，靜置30分鐘后觀察結果。從左至右第一列為四單位抗原，第二列為二單位抗原，第三列為一單位抗原，第四列為二分之一單位抗原，第五至第八列為空白對照。抗原回滴是用來評價四單位抗原配制的準確情況，在結果判定前先看抗原回滴的情況。如果一單位抗原的結果為100%凝集則四單位抗原配準確了（如圖A排）；如果一單位抗原沒有達到100%凝集，但達到了85%以上的凝集，二分之一單位抗原流下來一半（不流到底邊），也算準確；如果凝集圖形如C、D、E排那樣，則分別表示抗原偏少、抗原太少和抗原太多。血凝抑制試驗成功與否的判斷要素：陽性血清不超過標準值的±1個滴度；陰性對照血清在2Log2以下時為100%凝集；空白對照液體清亮，紅細胞流淌良好（100%陰性）；抗原回滴時結果準確。 □

[1] GB/T 16550-2008，新城疫診斷技術規程（S）.

[2] GB/T 18936-2003，高致病性禽流感診斷技術（S）.

[3] 常磊,孫婭莉,吳德喜,等.血凝和血凝抑制試驗的影響因素[J].中國家禽,2011,(16)：67～69.

[4] GB/T 17999.2-2008，SPF雞微生物學監測第2部分：SPF雞紅細胞凝集抑制試驗（S）.