端粒DNA形成不同構象的關鍵因素

武宇亭 張文梅 李小衛 趙紅衛

1（山西大學物理電子工程學院 現代通信技術研究所 太原 030006）

2（上海交通大學上海系統生物醫學中心教育部系統生物醫學重點實驗室 上海 200240）

3（中國科學院上海應用物理研究所 上海 201800）

端粒是真核細胞內線狀染色體末端的一種特殊結構，由 DNA簡單重復序列以及與序列專一性結合的蛋白質構成。端粒對染色體有保護作用，避免染色體末端融合、重組。人體端粒 DNA含有大量的重復單元，它們有雙鏈，也有單鏈形式。在富G(鳥嘌呤)單鏈中，G和 G間可通過氫鍵、陽離子偶極作用和范得華力形成 G-四聚體(G-quartet)平面結構，各G-quartet平面相互堆積便形成G-quadruplex結構[1,2]。與其互補的單鏈為富C(胞嘧啶)序列，通過C堿基的半質子化，C+?C堿基對形成穩定的平行雙螺旋，兩個平行雙螺旋 C+?C堿基對交替排列和相互嵌入形成 I-motif結構[3–5]。研究表明，正常細胞每次分裂會損失50–200個端粒DNA核苷酸，當端粒 DNA的長度減至足夠短時，細胞開始衰老和死亡[6]。與正常細胞不同，85%–90%的癌細胞中高活性端粒 DNA酶能不斷合成細胞分裂后損失的端粒DNA，從而使癌細胞無限制的分裂和繁殖。據文獻[7]，可通過蛋白適配復合體來抑制DNA的復制。近年來發現，富G序列形成的G-quadruplex結構能影響端粒酶的活性，也可抑制癌細胞分裂，因此，研究端粒 DNA G-quadruplex的形成對癌癥治療具有重要意義[8]。

相比于G-quadruplex，人們對I-motif的了解不足，但其與人體端粒DNA、著絲粒DNA、RNA夾層結構的相互作用及與某些蛋白結合，都表明I-motif有重要的生物作用。I-motif也可與G-quadruplex一樣作為抗癌藥物的作用靶點，其研究具有有重要的生物醫學意義[4]。

人們用核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance)、圓二色譜(Circular Dichroism Spectrum)、凝膠電泳等方法研究了G-quadruplex、I-motif的形成條件及其穩定性[9–13]，但對富C和富G序列共存條件下結構特征的報道并不多見。由不對稱分子組成的物質對左、右旋束圓偏振光吸收程度不同，這種吸收程度的不同與波長的關系稱圓二色譜。本文用圓二色譜考察了不同單鏈分別形成四鏈體的關鍵影響因素，并研究了兩單鏈混合時的結構特征。結果表明，在dAG3(T2AG3)3和 d(C3TA2)3C3T的混合溶液中很容易形成duplex結構，但去除對duplex結構有穩定作用的離子后則形成G-quadruplex、I-motif混合狀態。

1 材料和方法

1.1 樣品制備

由生工生物工程(上海)公司提供的寡核糖核酸5'-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'及其互補鏈 5'-CCCTAACCCTAACCCTAACCCT-3'， 經ULTRAPAGE純化，并由質譜檢測，分子量誤差≤0.1%，其純度達實驗要求。將寡核糖核酸溶于去離子超純水，測試樣品濃度為 50 μg/mL(約 2.5 mmol/L)，由HCl/NaOH調節溶液pH值，測試樣品中 Na+離子濃度為 50 mmol/L，所用 EDTA 為 1 mmol/L。

1.2 CD譜實驗

實驗所用圓二色光譜儀為日本分光公司JASCO J-815，采用1 mm樣品池，掃描范圍320–200 nm，掃描速度100 nm/min，步長1 nm。測定溫度為20oC，以同種離子條件緩沖液作參比。

2 結果與討論

2.1 dAG3(T2AG3)3與金屬離子

圖1為 dAG3(T2AG3)3在不同緩沖液中的 CD譜。溶于去離子超純水未添加其它試劑的樣品在235 nm處有一負峰，在255 nm和295 nm處各有一正峰，表明dAG3(T2AG3)3以單鏈形式存在。pH值為7的純水時，在240 nm附近有一負峰，在265 nm附近有一很小的正峰，同時在295 nm附近形成一個較強的正峰，對應于正平行G-quadruplex結構。這與文獻報道一致[11,14,15]。文獻[14]也提到 K+離子能促使這種結構的穩定。將dAG3(T2AG3)3溶于NaCl溶液中并調節溶液呈中性，dAG3(T2AG3)3會在295 nm處形成一正峰，在265 nm處形成一負峰，這與反平行G-quadruplex結構的CD譜特征峰相符。

圖1 dAG3(T2AG3)3溶于純水、pH 7水、50 mmol/L NaCl溶液中的CD譜Fig.1 CD spectra of dAG3(T2AG3)3 in pure water, water at pH 7, and 50 mmol/L NaCl solution.

研究表明，溶液中的 Na+離子會促使dAG3(T2AG3)3從正平行轉換到反平行四鏈體結構。這可能是由于正反平行四鏈形成的G-quadruplex中間孔徑大小不同，不同半徑的離子會促使不同結構的穩定，Na+離子與堿基中負性氧原子相互配位，從而促使反平行 G-quadruplex結構的形成和穩定[11]。文獻[16]認為與金屬離子的脫水自由能有關。但可以肯定的是在這個過程中伴隨有氫鍵的斷裂和重組以及糖苷鍵角的變化[15]。

2.2 dAG3(T2AG3)3與溶液pH

圖2為dAG3(T2AG3)3形成構象與溶液pH的關系。將dAG3(T2AG3)3溶于純水，在不同pH下，都形成了正平行G-quadruplex結構。將dAG3(T2AG3)3溶于 NaCl溶液，在不同的 pH下形成了反平行G-quadruplex結構。表明溶液 pH對正反平行G-quadruplex結構影響較小。結果與文獻[14]報道相符，但文獻[15]中指出pH會影響G-quadruplex結構的穩定性，在 pH=6.5時，其結構最為穩定，過酸過堿都會使G-quadruplex結構遭到破壞。

圖2 dAG3(T2AG3)3溶于pH 4.5和7.0的純水及pH 4.5和7.0的50 mmol/L NaCl溶液中的CD譜Fig.2 CD spectra of dAG3(T2AG3)3 in water at pH 4.5 and 7.0, and in 50 mmol/L NaCl at pH 4.5 and 7.0.

2.3 d(C3TA2)3C3T與溶液pH

圖3是d(C3TA2)3C3T在不同溶液環境下形成的構象。將d(C3TA2)3C3T溶于pH 4.5的NaCl溶液，在255 nm處呈現一負峰，在284 nm處有一正峰，對應于I-motif結構。在NaCl溶液中，當pH=7時，正負峰均產生紅移，分別位于250、275 nm，核磁共振實驗已證實，此時并未形成I-motif結構[9]，這些峰對應于單鏈結構。說明d(C3TA2)3C3T是否形成I-motif主要受溶液pH影響，而與金屬Na+關系不大，與文獻[14]結論相符。d(C3TA2)3C3T溶于純水CDS正負峰的位置與在pH 4.5的NaCl溶液中一致，說明純水中也形成了 I-motif結構，這是由于d(C3TA2)3C3T溶于水中使溶液呈酸性的緣故。

圖3 d(C3TA2)3C3T純水溶液和pH 4.5與pH 7.050 mmol/L NaCl溶液的CD譜Fig.3 CD spectra of d(C3TA2)3C3T in pure water,and in 50 mmol/L NaCl solution at pH 4.5 and 7.0.

2.4 dAG3(T2AG3)3/d(C3TA2)3C3T等摩爾混合

將等摩爾的單鏈 dAG3(T2AG3)3和d(C3TA2)3C3T溶于NaCl溶液，獲CD光譜(圖4)。

圖4 dAG3(T2AG3)3、d(C3TA2)3C3T等摩爾混合溶于50 mmol/L NaCl溶液( pH 4.5)和不同pH值添加EDTA的CD譜Fig.4 CD spectra of the equimolar mixture of dAG3(T2AG3)3 and d(C3TA2)3C3T in 50mmol/L NaCl solution at pH 4.5 or 7, and with EDTA added at pH 4.5.

當pH為4.5或7時，在265 nm處均有一個正峰，這是由于雙螺旋DNA堿基的堆積，而240 nm的負峰對應于DNA 雙螺旋B型構象[17]。然而加入EDTA后，在288 nm附近形成一個正峰，表明雙螺旋結構發生某種轉變。文獻[14]中提到在Na+及酸性的溶液中，會發生duplex和G-quadruplex、I-motif的競爭，三種結構會并存。但當其中含有Mg2+時，由于 Mg2+有穩固 duplex破壞四鏈體結構的作用，則僅有duplex結構。本研究中，可能所購DNA引物中含微量 Mg2+，使 duplex的形成有一定優勢，這樣就呈現出duplex特征譜。

圖5為將此 CD譜與 G-quadruplex、I-motif、duplex的CD譜進行對比，288 nm的正峰恰好位于I-motif 285 nm及G-quadruplex 294 nm兩正峰間，而 255 nm的負峰也恰好位于 I-motif 250 nm及G-quadruplex 263 nm兩負峰間。因此可推斷兩單鏈等摩爾混合及含有EDTA時未形成duplex結構，而是分別形成四鏈體結構，所得 CD譜中的峰是G-quadruplex、I-motif CD譜中峰的疊加。這是由于EDTA可以螯合溶液中微量 Mg2+離子，從而破壞duplex使單鏈分別形成了四鏈結構。

圖5 pH為4.5的50 mmol/L NaCl溶液中dAG3(T2AG3)3(22AG)、d(C3TA2)3C3(22CT)及其等摩爾混合液和加入EDTA的CD譜Fig.5 CD spectra of dAG3(T2AG3)3(22AG),d(C3TA2)3C3(22CT) and equimolar mixture with EDTA in 50 mmol/L NaCl at pH 4.5.

3 結語

本文利用圓二色譜研究了單鏈 dAG3(T2AG3)3和d(C3TA2)3C3T及其混合溶液形成不同構象的主要影響因素。研究結果表明，dAG3(T2AG3)3很容易形成正平行G-quadruplex結構，當溶液中含有Na+離子時形成反平行G-quadruplex結構，而pH值對于這種構象的改變影響甚微。d(C3TA2)3C3T形成四鏈則主要受pH值影響，其在酸性條件下形成I-motif結構。等摩爾dAG3(T2AG3)3和 d(C3TA2)3C3T的混合溶液中容易形成duplex雙螺旋結構，加入EDTA螯合溶液中穩定 duplex的離子后則形成G-quadruplex、I-motif混合狀態。

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