從人源大容量噬菌體抗體庫中篩選抗生存素抗體

王欲曉，解 鵬，高榮凱，楊東玲，周麗君

生存素(survivin)是由 Ambrosini等[1]在 1997年發現的，是凋亡抑制蛋白家族成員，由142個氨基酸組成的相對分子質量為16.5×103的蛋白。研究發現:survivin主要分布于胚胎及分化未成熟的組織，在成人體內僅在胸腺、甲狀腺、子宮內膜組織、生殖腺中有微量表達，在其他正常組織中均未檢測到其表達，而在大部分腫瘤中則高表達尤其是肺、乳腺、腦、腸等組織中。Survivin在進化上高度保守，具有調節細胞分化和抑制凋亡的功能，是目前已知作用最強的凋亡抑制蛋白之一。Survivin對細胞凋亡的抑制及其在腫瘤細胞中表達的特異性，使得以survivin為靶點治療惡性腫瘤的設想成為近年來研究的新熱點[2-3]。

國外已開展針對該蛋白的抑制劑、反義寡核苷酸、小分子干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)的研究，以期篩選到具有應用前景的治療藥物。目前，已經有多種針對survivin靶點的藥物開始進行Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗，如反義寡核苷酸LY21830B、轉錄抑制劑YM155等，并顯示出良好治療效果[4]。隨著基因工程技術的發展，治療性單抗已成為發展最快的生物藥物，是生物制藥的熱點，特別是針對惡性腫瘤的治療性抗體是開發最活躍的領域。如用于治療乳腺癌的曲妥珠單抗、治療B淋巴細胞瘤的利妥昔單抗等在臨床應用中均顯示了良好的效果[5]。但針對細胞內survivin蛋白的治療性人源抗體研究鮮見報道。我們實驗室在軍隊“十五”重點課題的資助下，構建了經重組酶系統cre-loxp定位介導的大容量天然抗體庫，并從中篩選到針對不同抗原的多株人源抗體[6-7]。本研究嘗試從該抗體庫中篩選出人源抗survivin抗體，探討其在今后腫瘤治療中的應用。

1 材料與方法

1.1 大容量抗體庫及主要試劑 大容量噬菌體抗體庫為本中心構建，survivin由海軍總醫院檢驗科郭建巍博士贈送[8]，輔助病毒VCSM13、大腸桿菌菌株XL1-Blue為本中心保存，各種內切酶均為promega公司產品，辣根過氧化物酶-V5(horseradish perroxidase，HRP-V5)、卵清蛋白(ovalbumin，OA)和鐵蛋白(ferritin，Fer)購自美國SIGMA 公司，HRP-抗M13購自美國通用電氣公司，survivin兔多抗購自中杉金橋公司、HRP-羊抗兔IgG購自英國Abcam公司，抗原管(immuno-tube)購自丹麥NUNC公司。

1.2 大容量噬菌體抗體庫的優化與制備 初級噬菌體抗體庫以100∶1的比例復合感染(multiplicity of infection，MOI)BS1365細胞，37℃水浴保溫1 h，使多副本載體進入同一個細胞，加含氨芐青霉素(ampicillin，Amp)的2YT 培養液至 400 ml，Amp 終濃度為100 μg/ml。振蕩培養至吸光度A600=0.5左右加5 ml輔助病毒VCSM13(滴度1.7×1012cfu/ml)，30℃培養過夜，離心回收上清，聚乙二醇8000(polyethylene glycol 8000，PEG8000)沉淀回收，測定滴度。再以MOI≤1的比例感染1 000 ml對數生長期的 XL1-Blue菌，37℃靜止30 min;取少量鋪含Amp的培養盤計算庫容，補足 Amp，加入8 ml VCSM13，30℃過夜，次日回收上清，常規 PEG8000沉淀。1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶解[9-10]。

1.3 抗survivin噬菌體抗體的篩選 將survivin抗原用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液Buffer稀釋至50 μg/ml，以1 ml包被免疫管，4℃過夜，次日用3%脫脂奶封閉2 h，加入1 ml噬菌體抗體庫(約1×1013cfu/ml)，37℃孵育2 h，以含0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸酯(Tween)-20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗15次(第1輪洗15次，第2～4輪洗滌20次以上)，加入1 ml新鮮XL1-Blue菌直接感染，37℃孵育15 min，在孵育過程中輕輕的搖動幾次，使其更好地與抗體結合，提高感染的效果，轉入10 ml超級營養肉湯(super broth，SB)培養液中;從回收的菌液取適量鋪在含有Amp培養盤測定滴度，其余菌液37℃培養1 h，加入含有Amp培養液增至為100 ml，2～3 h后，長到對數生長期加入1 ml滴度為2.3×1012cfu/ml輔助病毒VCSM13，30℃振蕩培養過夜。每輪篩選后均測定次級庫的滴度，并計算噬菌體抗體的回收率[11-12]。

1.4 噬菌體抗體的制備 從篩選第3、第4輪的培養盤隨機挑取集落在含有Amp的2YT培養液中培養過夜，第2天取30 μl細菌到1 ml SB培養液中，37℃培養至對數生長期，加入輔助病毒VCSM13，30℃培養過夜，離心收取上清即得到噬菌體抗體。

1.5 酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法鑒定噬菌體抗體 將survivin稀釋至 2 μg/ml，以每孔 50 μl包被 ELISA 板，4℃過夜，棄去孔內液體，用3%脫脂奶-PBS封閉2 h后加入待檢測的噬菌體抗體液，37℃孵育2 h，用0.05%Tween-20 PBS注滿洗滌3次，加入二抗HRP-抗M13鼠單抗，孵育1 h，洗滌后加入鄰苯二胺鹽酸鹽(O-phenylendiamine dihydrochloride，OPD)底物顯色，讀取吸光度A490值。顯色陽性的克隆再以survivin、OA、Fer為抗原同時包被ELISA板，鑒定其抗原抗體反應的特異性。

1.6 可溶性抗體的的表達及檢測 用陽性噬菌體抗體感染HB2151菌株后鋪含Amp培養盤，第2天挑克隆，細菌在對數生長期加入異丙基-β-D-硫化半乳糖苷(1 mmol/L)28℃誘導，得到可溶性的抗體。ELISA方法同上，加入待檢測的可溶性上清，以HRP-V5為二抗;陽性對照孔加入1∶500稀釋的抗survivin兔多抗，二抗為1∶1 000稀釋的HRP-羊抗兔IgG，分別檢測上清中單鏈的表達與生長素的結合活性及其特異性。

2 結果

2.1 工作庫制備結果 原始噬菌體抗體庫通過重組酶系統cre-loxp介導的定位重組，擴增出一個新的大容量噬菌體庫，獲得庫容為4×1010的大容量人源噬菌體抗體庫，所獲抗體庫滴度為3×1012cfu/ml。

2.2 抗survivin噬菌體抗體的篩選結果 經過4輪的篩選，測定每輪洗脫回收的噬菌體滴度，發現有一定的富集(表1)。

表1 噬菌體抗體庫的投入產出比

2.3 抗survivin噬菌體抗體結合活性 從第3、第4輪菌落中隨機挑取100個克隆，制備噬菌體抗體。ELISA表明，21個能與 survivin抗原結合，隨后用OA、Fer作為對照鑒定，特異性結合的克隆為10個。表2為從中選取的4個結合活性較高的陽性克隆、1個陰性克隆與各抗原反應結果。

表2 噬菌體抗體與不同抗原反應的ELISA檢測

2.4 可變區基因的多樣性分析(DNA指紋) 將篩選到的10個噬菌體陽性克隆進行可變區基因擴增，酶切消化得到DNA指紋圖譜，10個陽性菌落系來自8種不同的scFv基因克隆，其中2、6、9為相同指紋(圖1)。

圖1 陽性克隆可變區基因的指紋圖譜

2.5 可溶性scFv抗體的表達 將篩選出的特異性8種噬菌體克隆，制備可溶性抗體，用OA、Fer進行特異性鑒定，其中5個克隆經ELISA檢測具有較高的特異結合活性。

表3 可溶性抗體與不同抗原反應的ELISA檢測

3 討論

噬菌體抗體庫技術出現于20世紀90年代初期，是將全套人的抗體基因克隆到噬菌體載體中，利用其呈現在噬菌體表面的特點，經過幾輪“吸附—洗脫—擴增”的淘篩，除可以方便地用不同抗原篩選出相應的人源抗體外，還可以同時獲得針對同一抗原的不同基因型的多株抗體，顯示了其良好的應用前景[13-14]。

細胞內抗體可在細胞內表達或直接進入細胞，與特定的靶分子作用(干擾或阻斷靶分子的加工、分泌或功能)從而發揮其生物學功能的抗體[15]。隨著分子生物學技術的發展，越來越多具有重要作用的細胞內功能蛋白質被發現。細胞內抗體一方面可作為一種外源性重組抗體，特異性地作用于細胞內抗原，作為表型基因敲除的研究工具;另一方面，如果將抗體的結構域與適當的定位信號融合組裝，即可將其定位在細胞內靶抗原的相應位置，達到抑制靶蛋白功能。腫瘤基因治療也是細胞內抗體技術應用的一個重要領域，這方面的研究主要集中在腫瘤細胞高表達的某些蛋白及與腫瘤細胞耐藥、侵襲和轉移相關的蛋白上。如酪氨酸激酶家族成員erbB-2在調節細胞生長和分化中起重要作用，抗erbB-2細胞內抗體用于卵巢癌患者治療已進入Ⅰ期臨床。又如Cyclin E是調節正常細胞分裂的一種重要的細胞周期蛋白，在乳腺癌中高表達，細胞內表達的抗Cyclin E抗體可抑制乳腺癌細胞的生長[16-17]。

單鏈抗體是由可變區域重鏈VH和可變區域輕鏈VL中間加一段linker構成，與完整抗體及抗體的Fab段相比具有相對分子質量小、免疫原性低、穿透力強等優點，一般用其作為細胞內抗體[18]，有利于作為“導向載體”等應用于人體。本研究中，我們利用人源大容量噬菌體抗體庫篩選到多株針對survivin特異性結合的人源抗體。由于survivin蛋白存在于細胞內，下一步我們將對獲得抗體進行生物功能的測定，以期獲得具有臨床應用前景的人源抗survivin抗體。

[1]Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med，1997，3(8):917-921.

[2]Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death[J].Oncogene，2000，19(10):1346-1353.

[3]Sah NK，Khan Z，Khan GJ，et al.Structural，functional and therapeutic biology of survivin[J].Cancer Lett，2006，244(2):164-171.

[4]Altieri DC.Survivin，cancer networks and pathway-directed drug discovery[J].Nat Rev Cancer，2008，8(1):61-70.

[5]Nelson AL，Dhimolea E，Reichert JM.Development trends for human monoclonal antibody therapeutics[J].Nat Rev Drug Discov，2010，9(10):767-774.

[6]王欲曉，賈培媛，王玉霞，等.人源抗棱曼過渡態類似物(P6)的抗體篩選[J].細胞與分子免疫學雜志，2010，26(3):250-252.

[7]Du L，Zhou LJ，PAN XJ，et al.Radiosensitization and growth inhibition of cancer cells mediated by an scFv antibody gene against DNA-PKcs in vitro and in vivo[J].Radiat Oncol，2010，5:70.

[8]郭建巍，王小平，馬驄，等.Survivin蛋白的原核表達及在腫瘤診斷中的初步應用研究[J].中國實驗診斷學，2007，11(12):1576-1581.

[9]喬媛媛，王琰，陳曉穗，等.大容量噬菌體抗體庫的構建及鑒定[J].中華微生物學和免疫學雜志，2004，24(3):194-197.

[10]Sblattero D，Bradbury A.Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries[J].Nat Biotechnol，2000，18(1):75-80.

[11]王琰，劉群英，化冰，等.從人源性噬菌體抗體庫分離出1株含有異常序列的抗HBsAg Fab克隆[J].中國免疫學雜志，1998，14(2):115-118.

[12]Qiao Y，Zhou L，Wang Y，et al.Screening for antibodies against intact cancer cells with a naive large phage antibody library[J].Int J Mol Med，2012，29(1):37-46.

[13]Griffiths AD，Willisms SC，Hartley O，et al.Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires[J].EMBO J，1994，13(14):3245-3260.

[14]Sblattero D，Bradbury A.Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries[J].Nat Biotechnol，2000，18(1):75-80.

[15]Wheeler YY，Chen SY，Sane DC.Intrabody and intrakine strategies for molecular therapy[J].Mol Ther，2003，8(3):355-366.

[16]Alvarez RD，Barnes MN，Gomez-Navarro J，et al.A cancer gene therapy approach utilizing an anti-erbB-2 singlechain antibody-encoding adenovirud(AD21):a phaseⅠtrial[J].Clin Cancer Res，2000，6(8):3081-3087.

[17]Strube RW，Chen SY.Characterization of anti-cyclin E single-chain Fv antibodies and intrabodies in breast cancer cells:enhanced intracellular stability of novel sFv-Fc intrabodies[J].J Immunol Methods，2002，263(1/2):149-167.

[18]Beckman RA，Weiner LM，Davis HM.Antibody constructs in cancer therapy:protein engineering stragies to improve exposure in solid tumors[J].Cancer，2007，109(2):170-179.