模擬失重降低大鼠血清和下頜下腺Ghrelin水平

張金山 趙潔 李臻等

[摘要] 目的 觀察模擬失重狀態(tài)下大鼠血清和下頜下腺內(nèi)Ghrelin表達的變化，為探討航天失重環(huán)境下消化系統(tǒng)功能紊亂的機制提供實驗依據(jù)。 方法 采用尾懸吊模擬失重模型，30只Sprague-Dawley大鼠隨機分為4周懸吊組（n=15）和正常對照組（n = 15），用酶免疫分析（EIA）法測定動物血清和下頜下腺組織中Ghrelin的濃度。 結(jié)果 與正常對照組比較，模擬失重組大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平均顯著降低[（7.14±1.65）μg/L vs （5.72±1.42）μg/L，P < 0.05；（8.36±1.87）μg/gvs （6.45±2.06）μg/g，P<0.01）]。 結(jié)論 模擬失重環(huán)境可致大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平下降，Ghrelin可能參與模擬失重環(huán)境下消化系統(tǒng)功能紊亂的調(diào)節(jié)。

[關(guān)鍵詞] 模擬失重；Ghrelin；血清；下頜下腺；大鼠

[中圖分類號] R576.06[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-7210（2012）05（c）-0029-03

失重導致的宇航員厭食和體重下降是當前航天醫(yī)學研究的重要領域之一。航天性厭食癥表現(xiàn)為航天飛行過程中出現(xiàn)熱量攝入減少和體重下降，嚴重影響航天員的耐力和執(zhí)行力[1]。失重導致航天員消化道功能紊亂（如厭食癥和體重下降）的機制仍不完全清楚。攝食相關(guān)激素與食欲和維持機體的能量穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，目前已知與航天性厭食和體重下降有關(guān)的攝食相關(guān)激素包括神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）、5-羥色胺（serotonin，5-HT）、促皮質(zhì)激素釋放素（corticotropin-releasing factor，CRF）和瘦素等[2-4]。Ghrelin是生長激素促分泌劑受體（GHS-R）的內(nèi)源性配體，可刺激食欲及攝食，調(diào)節(jié)機體能量平衡，促進胃動力和胃酸分泌，促進生長激素釋放、抗炎癥及調(diào)節(jié)免疫反應等功能[5-6]。最近的研究表明，人和哺乳類動物唾液腺可合成和分泌Ghrelin，唾液中亦檢出Ghrelin蛋白[7-9]。志愿者頭低位傾斜臥床模擬失重模型中，唾液中應激因子（α-淀粉酶、皮質(zhì)酮、CgA和β-內(nèi)啡肽）水平明顯升高，提示模擬失重可導致唾液腺分泌功能的變化[10]。為探討Ghrelin在航天所致消化系統(tǒng)功能紊亂中的作用及其機制，本研究采用尾懸吊大鼠模型，觀察模擬失重大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平的變化，為深入研究航天失重所致消化功能紊亂的機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只（第四軍醫(yī)大學訓練部實驗動物中心提供），體質(zhì)量180～200 g，動物飼養(yǎng)與實驗過程均遵守本校實驗動物飼養(yǎng)與使用的規(guī)定。

大鼠血清Ghrelin檢測EIA試劑盒購自ADL（Adlitteram Diagnostic Laboratories）公司。

1.2 方法

1.2.1 模擬失重大鼠模型按隨機原則將大鼠分為模擬失重組（n=15）和正常對照組（n=15）。采用-30°尾懸吊模擬失重動物模型，每只籠內(nèi)懸吊一只大鼠，尾部懸于籠頂，使鼠前肢踏于籠底的塑料棒上，后肢懸空，身體縱軸與水平面成30°；正常對照組除不懸吊外，其他條件與模擬失重組相同，實驗期間兩組大鼠均可自由攝食和飲水。

1.2.2 大鼠血清和下頜下腺組織制備尾懸吊模擬失重4周結(jié)束后，將兩組大鼠在烏拉坦（1.2 g/kg體重）腹腔注射麻醉下，剖開胸腔，暴露心臟，用一次性注射器左心室內(nèi)取血3 mL于4℃靜置2 h，4 000 r/min離心15 min取上清液，置-70℃保存?zhèn)溆谩Ｈ缓笞鲱i部切口，分離下頜下腺組織，稱重，用2 mL勻漿器勻漿（加1 mL PBS），組織勻漿液用樣品稀釋液稀釋5倍。-70℃保存，留待EIA檢測。

1.2.3 大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平檢測應用酶免疫分析（enzyme immunoassay，EIA）方法檢測懸吊和正常對照大鼠血清中和下頜下腺組織中Ghrelin水平。EIA檢測的具體操作步驟按試劑盒說明書進行，主要程序如下：①于空白微孔內(nèi)依次滴加標準品、血清或組織勻漿樣品100 μL；②于標準品或樣品孔中加入酶標記液50 μL；③37℃孵育反應60 min；④洗板機清洗5次，每次靜置20 s；⑤在標準品或樣品孔中加入底物A、B液各50 μL；⑥37℃下避光孵育反應15 min；⑦每孔內(nèi)加入終止液50 μL，終止反應；⑧輕輕混勻，30 min內(nèi)用酶標儀檢測各孔的A值（450 nm濾色片）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

尾懸吊模擬失重組與正常對照組大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平的EIA檢測結(jié)果見表1。與正常對照組比較，模擬失重大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平均顯著低于正常對照組（P<0.05或P<0.01）。

3 討論

失重是航天過程中重要的環(huán)境因子，可引起機體多種器官系統(tǒng)的生理功能改變，因而對失重狀態(tài)下宇航員身體各器官系統(tǒng)變化的研究日益受到重視。長期處于失重環(huán)境中，航天人員易出現(xiàn)食欲下降、腹脹和消化不良等胃腸功能紊亂癥狀，并導致攝食減少和體重下降。目前已有一些針對失重狀態(tài)下胃腸功能變化的研究，如模擬失重狀態(tài)可造成腸道菌群失調(diào)；血循環(huán)和胃腸黏膜中神經(jīng)肽和胃腸激素（生長抑素、胃動素、5-HT、CRF、NPY/AgRP和瘦素等）水平改變；小腸黏膜微絨毛和絨毛表面積減少且排列紊亂；腸系膜動脈血管收縮，導致小腸血供減少等。Ghrelin是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一種GHS-R內(nèi)源性配體，循環(huán)中的Ghrelin主要由胃X/A樣細胞產(chǎn)生，有酰基化和去酰基化兩種存在形式。血循環(huán)中酰基化的Ghrelin只占很少的一部分，其酰基化過程由Ghrelin酰基轉(zhuǎn)移酶（Ghrelin O-Acyltransferase，GOAT）完成。酰基化Ghrelin通過GHS-R1a型受體發(fā)揮作用，GHS-R1a廣泛分布于人體多種組織，如下丘腦、垂體、海馬、大腦皮質(zhì)、胃腸胰系統(tǒng)、腎、心肌、腎上腺、肺、卵巢和肌肉等。由此可見，Ghrelin在消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌、心血管、生殖及免疫系統(tǒng)均可能發(fā)揮生物學功能[6]。

本研究結(jié)果表明，4周尾懸吊模擬失重大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平均顯著下降，說明模擬失重可引起體內(nèi)Ghrelin生成和分泌活動減弱，由于Ghrelin可刺激食欲和促進攝食行為，這一研究結(jié)果可部分解釋航天失重時出現(xiàn)的食欲下降和厭食。下頜下腺可合成和分泌多種生物活性物質(zhì)，參與機體的多種生理反應。Rai等[10]對12例男性志愿者所作的-6°頭低位臥床21 d模擬失重模型的研究發(fā)現(xiàn)，臥床1周后受試者出現(xiàn)心理應激反應，唾液中應激性激素CgA、皮質(zhì)醇、α-淀粉酶和β-內(nèi)啡肽水平較臥床前顯著升高，并在隨后的2周臥床期間繼續(xù)緩慢升高。唾液腺組織中Ghrelin的定位研究多來自人的材料，Aydin等[8]首先比較了青年健康人群血漿和唾液中Ghrelin水平，發(fā)現(xiàn)唾液中Ghrelin水平顯著高于血漿，免疫組化染色顯示唾液腺導管上皮細胞呈Ghrelin免疫反應陽性。隨后的研究表明[7，9]，唾液腺可合成與分泌Ghrelin，Ghrelin-mRNA表達于人腮腺和下頜下腺、而舌下腺內(nèi)未檢出Ghrelin-mRNA；Ghrelin蛋白廣泛表達于腮腺和下頜下腺紋狀管、閏管、分泌管和漿液性腺泡細胞的胞漿，但舌下腺的黏液性腺泡細胞無Ghrelin蛋白表達。腮腺和下頜下腺的合成與釋放是唾液中Ghrelin的主要來源。

多種疾病時可出現(xiàn)唾液和血漿Ghrelin的波動。肥胖型2型糖尿病患者唾液中Ghrelin水平顯著下降；胃癌和唾液腺黏液表皮癌組織中Ghrelin表達亦明顯降低；癲癇患者治療前血清和唾液腺Ghrelin水平顯著低于正常對照；病理性肥胖和正常人群空腹唾液Ghrelin水平顯著高于血清，病理性肥胖人群標準餐后血清Ghrelin水平無明顯受抑制，而唾液中Ghrelin水平卻顯著下降[11-14]。

有關(guān)Ghrelin在唾液腺表達的功能研究證明，Ghrelin可促進口腔黏膜上皮細胞增殖，并且這種作用可被Ghrelin特異性抑制劑NOX-B11阻斷[9]。Ohta等[15]觀察Ghrelin對TNF-α或LPS刺激下口腔上皮細胞IL-8分泌的影響。發(fā)現(xiàn)Ghrelin可增加口腔上皮細胞內(nèi)鈣動員和cAMP水平；合成的Ghrelin抑制TNF-α或LPS刺激下口腔上皮細胞IL-8的合成與分泌，提示Ghrelin可對炎性感染的固有免疫反應起調(diào)節(jié)作用。Ghrelin抗LPS-誘導的腺泡細胞凋亡活動與cNOS活性增強、iNOS和Caspase-3表達下降有關(guān)，Ghrelin參與SrC/Akt-介導的cNOS活化和NO-誘導的Caspase-3 S-亞硝基化凋亡信號途徑[16]。

本研究通過對模擬失重狀態(tài)下大鼠血清和下頜下腺Ghrelin表達的檢測，證明了Ghrelin可能在航天失重環(huán)境下機體內(nèi)分泌和代謝紊亂中發(fā)揮重要作用。進一步探討失重條件下Ghrelin與其他攝食相關(guān)激素之間的相互作用，將有助于闡明失重引起胃腸功能紊亂的機制，為完善載人航天醫(yī)務保障提供理論支持。

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（收稿日期：2012-03-19本文編輯：衛(wèi) 軻）