肽鍵構建的新途徑

李 揚 徐開俊 郭守河 陸 濤*

（中國藥科大學，江蘇 南京211198）

酰胺類化合物具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗變態反應等；同時，它們是一類非常重要的有機合成中間體。制備酰胺應用最廣的方法是通過將羧基活化，使羧酸活化為酰氯、疊氮、對稱酸酐以及混合酸酐，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋，以及反應試劑危險以及制備比較復雜，逐漸被后來的縮合試劑取代。

盡管使用縮合試劑制備多肽取得了不小的進展，但依然有它的三大局限性。隨著多肽類化合物在藥物治療中起到愈加重要的作用，采用化學手段合成多肽顯得極為迫切。近幾年來，Marder等[1]掀起了采用新的化學合成方法制備多肽化合物的熱潮，本綜述總結了近幾年中在肽鍵合成領域最具突破性的新方法和新機制，側重于那些尚未普遍推廣，但有可能克服目前合成方法中遇到的困難的新合成途徑。

1 具有醫學活性的多肽片段的固相合成

多肽的化學合成主要依靠固相合成方法（Solid-Phase Peptide synthesis，SPPS）。該方法按照目標多肽分子的氨基酸序列將其在樹脂上依次組裝起來，合成策略基本成熟，操作也較為簡單，但其合成目標分子的能力依賴于每步的偶聯效率。由于在反應過程中各種副產物在樹脂上會逐步積累，導致反應產物純度隨肽鏈增長而顯著降低，給目標分子的分離和純化帶來較大的困難。

目前高度優化的固相多肽合成方法也局限于合成約含50～60個氨基酸單元的肽鏈，因為包含50～60個氨基酸肽鏈的化學穩定性較差（即避免強酸、強堿、高溫等）。此外，由于多肽片段的分子量較大（約3000～10000 Dalton），因此反應溶液中底物的濃度也有較大限制（通常＜0.001mol/L），這些限制使得多肽連接反應成本高，效率低。

2 天然化學連接（Native chemical ligation）及其延伸方法

Native chemical ligation（簡寫為NCL）是目前發現的最高效的多肽化學合成方法之一。Kent等人發現硫酯Val-SPh和半胱氨酸CysOH能夠在水溶液中快速地生成二肽Val-CysOH，而他發明的NCL方法巧妙的利用了要一個C端為硫酯的多肽片段，以及一個N端為半胱氨酸殘基的多肽片段（一般為具有特定化學結構的、而且沒有保護基團保護的多肽片段），在水溶液體系中進行高度化學選擇性的耦合反應，生成連接位點為天然肽鍵的蛋白質分子[2]。見圖1。

利用天然化學連接技術合成的多肽中必須含有Cys殘基作為連接位點。研究表明，僅1.7%的蛋白質含Cys殘基，而且Cys殘基在蛋白質序列中的位置也不一定是很好的縮合位點，因此，研究人員開始對天然化學連接技術進行了延伸，發明了化學區域選擇連接（ Chemo- and regioselective ligation）[3]，這是一項擬Cys位點的連接技術，該方法利用C端的硫酯與N端輔助基中的巰基發生酯交換反應，生成新的中間體，該中間體經過分子內的酰基遷移，得到多肽。見圖2。

3 施陶丁格連接（Staudinger ligation） 及其改進

施陶丁格連接與天然化學連接方法都是多肽合成的重要方法。見圖3。

Bardley等雖然驗證了該方法是一種有效的片段縮合方法，但同時發現膦硫酯作為輔助基對一些氨基酸縮合率很低，如以Gly為縮合位點，縮合率不超過35%。Williams等對施陶丁格連接進行了改進，他們使用硫代酸和疊氮化合物反應，得到五元環中間體水解形成肽鍵。這種新的方法稱為硫代酸-疊氮連接（Azide-thioacid ligation）[4]。見圖4。

4 酮酸-羥氨連接（Ketoacid-hydroxylamine amide ligations）

加州大學的科研小組發現了一種新的高效而且具備化學選擇性的形成肽鍵的方法，該方法通過脫羧的羥氨和α-酮酸耦合，在不需要添加任何縮合試劑的條件下，直接反應形成酰胺鍵，副產物為水和二氧化碳。見圖5。

5 采用極性反轉的方法合成多肽化合物

圖1 天然化學連接反應步驟圖

圖2 化學區域選擇連接反應步驟圖

圖3 施陶丁格連接反應步驟圖

圖4 硫代酸-疊氮連接反應步驟圖

圖5 酮酸-羥氨連接反應制備多肽化合物

圖6 極性反轉法構建酰胺鍵

圖7 極性反轉法制備多肽化合物

傳統肽鍵合成采用羧基和氨基通過縮合的方式。但是在遇到空間位阻增加的時候，如二取代胺，芳基甘氨酸等物質，縮合的效果往往不盡如人意，美國范德堡大學（Vanderbilt University）的研究人員發現了一種生成肽鍵的具有高度化學選擇性新方法。該方法使用溴化硝基烷烴與碘活化的胺反應產生酰胺。該反應提供了生產非天然氨基酸酰胺和多肽的新途徑[5]。見圖6。

圖8

當反應分子體積增大、位阻或立體化學復雜程度增強的時候，縮合反應有時就難以達到要求。比如芳香基甘氨酸的肽鍵生成中就常會伴隨一定程度的消旋（導致純度降低）。而新的這一方法可以和不對稱的aza-Henry反應連用，使用溴化硝基烷烴作為羧酸的替代物，與碘活化的胺反應，反應物的極性與經典的脫水縮合反應相反（umpolung），成功避免了芳香基甘氨酸的酰胺產生過程中的消旋[6]。見圖7。

研究人員發現溴帶硝基烷烴可以提供一個合適的氧化態與氨基接合。見圖8。

在酰胺鍵形成中，先形成親電性的鹵代胺，然后與硝酸酯發生反應，最終脫去硝基形成酰胺鍵。在反應中NIS（碘代琥珀酰亞胺）起到活化一級或者二級胺的作用，在不加入胺的情況下，會形成α-溴，α-碘的硝基烷烴，從而導致沒有目標產物生成。此外溴化硝基烷烴并不與羥基發生類似酯化反應，大大降低了副產物的生成。

6 結論與展望

總體來說，多肽的化學全合成技術還不夠完善，合成領域中存在著各式各樣的的問題。比如，溫度變化會導致多肽的構象改變，如何調整溫度達到最佳效果，如何在合成過程中最小化外消旋作用；尋找更好的溶劑和縮合劑來提高縮合率。這一系列問題還有待于進一步研究和探索。

[1] Marder O,Albericio F.Industrial application of coupling reagents in peptide synthesis[M].Chimica Oggi,2003：6-11.

[2] Muir TW.Development and application of expressed protein ligation[J].Synlett,2001(6)：733-740.

[3] Casi G,Hilvert D.Convergent protein synthesis[J].Curr Opin Struct Biol,2003,13(5)：589-594.

[4] Fazio F,Wong CH.RuCl3-promoted amide formation from azides and thioacids[J].Tetrahedron Lett,2003,44(51)：9083-9085.

[5] Carrillo N,Davalos EA,Russak JA,et al.Iterative,aqueous synthesis of β3-oligopeptides without coupling reagents[J].JAm Chem Soc,2006,128(5)：1452-1453.

[6] Shen B,Makley DM,Johnston JN.Umpolung reactivity in amide and peptide synthesis[J].Nature,2010,465(7301)：1027-1032.