熱休克蛋白27增強A型流感病毒NS1對β干擾素的抑制作用

李錚，劉曉玲，趙振東，劉文軍

1 中國科學院微生物研究所 中國科學院病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101

2 中國科學院研究生院，北京 100049

醫學與免疫生物技術

熱休克蛋白27增強A型流感病毒NS1對β干擾素的抑制作用

李錚1,2，劉曉玲1，趙振東1,2，劉文軍1

1 中國科學院微生物研究所 中國科學院病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101

2 中國科學院研究生院，北京 100049

熱休克蛋白27 (Heat shock protein 27，HSP27) 是一種具有多重功能的小熱休克蛋白，它在一些病毒的生命周期中也發揮著重要作用。為研究HSP27對流感病毒感染的調節作用，首先在原核及真核細胞中克隆并表達了人源的HSP27蛋白，并驗證了HSP27和A型流感病毒NS1蛋白能夠相互結合。通過熒光素酶檢測試驗發現，HSP27可以抑制病毒感染細胞中β干擾素 (IFN-β) 的表達，但不依賴于其自身的磷酸化狀態，而且HSP27與NS1共同對于IFN-β的表達具有疊加抑制效果。進一步的結果表明HSP27可能通過RIG-I樣RNA解旋酶 (RLH) 途徑中MDA5因子抑制IFN-β的表達。研究表明，HSP27在被感染細胞的天然免疫中發揮一定作用，有助于進一步闡明宿主因子對于流感病毒感染的調節機理。

熱休克蛋白27，NS1蛋白，相互作用，β干擾素

Abstract:Heat shock protein 27 (HSP27) is a member of the small heat shock proteins (sHSP) and has multiple functions, it also plays an important role in the life cycle of some viruses. To investigate the regulatory effect of HSP27 during influenza virus infection, we cloned and expressed human HSP27 in both prokaryotic and eukaryotic cells, and demonstrated that HSP27 interacted with influenza A virus NS1 protein bothin vivoandin vitro. Luciferase assay showed that HSP27 inhibited the expression of interferon-β (IFN-β) in infected cells, and independent of its phosphorylation.Moreover, HSP27 enhanced the inhibitory effect of NS1 on the expression of IFN-β. Further analysis indicated that HSP27 exerted the inhibitory effect probably through influencing MDA5 of the RIG-I like helicase (RLH) pathway. The results suggested that HSP27 play a role in the innate immunity of infected cells, contributed to our understanding of the regulatory effect of host factors during influenza virus infection.

Keywords:heat shock protein 27, NS1 protein, interaction, interferon-β

流感病毒屬于正黏液病毒科，是一種囊膜病毒。其中A型流感病毒是哺乳動物中傳播的主要類型，其基因組包含8個單股負鏈RNA片段，編碼12種蛋白，20世紀以來人類所經歷的4次流感大流行全部由A型流感病毒引起，給人類帶來嚴重危害[1-4]。流感病毒在其感染周期中，會利用多種宿主因子來輔助自身生命過程，因此，有關宿主蛋白對流感病毒感染的調節機理的研究具有十分重要的意義。

NS1蛋白是A型流感病毒NS基因編碼的一種非結構蛋白，它僅在病毒感染細胞中表達。NS1蛋白在病毒感染過程中發揮多重作用，包括抑制細胞pre-mRNA的剪切和mRNA的出核[5-8]，增強病毒mRNA的翻譯[9-10]等；其中，NS1最重要的功能是拮抗流感病毒感染細胞的免疫反應，它通過兩種機制抑制β干擾素 (IFN-β) 的表達[11]：在轉錄前水平，可與RLH通路中RIG-I結合，阻礙IPS-1、IRF3的激活，從而抑制IFN-β啟動子的激活[12-13]；在轉錄后水平，通過和 CPSF30及PABPⅡ結合，阻斷細胞mRNA的出核，抑制IFN-β 的表達[6,14]。

熱休克蛋白27 (HSP27) 是一種在細胞中廣泛存在，不依賴于ATP的伴侶蛋白，屬于小熱休克蛋白家族的成員[15-16]，它可促進受損傷或構象異常的蛋白進行重新折疊，維持細胞穩態[17]。除作為分子伴侶外，HSP27還可作為調控因子，調節細胞膜的穩定性、細胞骨架的形成、細胞增殖及凋亡、細胞周期的進行、信號轉導等過程[16,18-20]。在應激條件下，HSP27的第15、78、82位絲氨酸常會發生磷酸化，且寡聚化狀態發生改變，從而行使其生物學功能[16]。有研究發現，在流感病毒的病毒粒子中，可以檢測到 HSP27蛋白的存在[21]，而H9N2流感病毒感染后的人胃腺癌細胞AGS中，HSP27蛋白的表達上調[22]，但對于 HSP27在病毒感染中所發揮的功能仍不清楚。

為了探討 HSP27蛋白在流感病毒感染周期中的具體作用，我們分別在原核及真核細胞中克隆、表達了人源的 HSP27蛋白，驗證了 HSP27和 NS1的相互作用，而且發現，HSP27可能通過RLH通路中MDA5因子，和NS1共同抑制被感染細胞中IFN-β的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體及菌株

大腸桿菌DH5α、BL21由本實驗室保存。載體 pET-28a、pGEX-4T-2、pCMV-Myc、pcDNA3-Flag，質粒 pCMV-β-gal、pIFN-β-luc、pEF-Flag-RIG-IN、pEF-Flag-mda-5H、pcDNA3.1/Zeo-MAVS、pcDNA3.1-Flag-TBK1、pIRES-hrGFP-IRF3/5D質粒由本實驗室保存。

1.1.2 細胞株、病毒株

293T細胞系、流感病毒A/WSN/33、仙臺病毒SeV由本實驗室傳代并保存。

1.1.3 主要試劑及引物

各種工具酶均購自TaKaRa公司；點突變試劑盒贈自北京諾派生物科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司；蛋白預染Marker購自Fermentas公司；Myc抗體購自Santa Cruz公司；Flag抗體、anti-FlAG-M2-agarose、DAPI、多聚甲醛、BSA購自 Sigma-Aldrich公司；sepharose 4B-glutathione購自GE公司；Trizol購自Invitrogen公司；β-actin抗體、FITC標記羊抗鼠IgG、TRITC標記羊抗兔IgG購自康為世紀公司；辣根過氧化物酶 (HRP) 標記羊抗鼠、羊抗兔IgG購自中杉金橋公司；HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司；熒光素酶檢測試劑盒、AMV逆轉錄酶購自Promega公司；鄰硝基苯 β-D-半乳吡喃糖苷 (ONPG)、Triton X-100購自Amresco公司。引物由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HSP27表達載體的構建

取生長狀態良好的 293T細胞，43 ℃熱擊20 min后，重新置于37 ℃培養箱中恢復培養4 h。Trizol法提取細胞總RNA。以總RNA為模板進行RT-PCR，獲得cDNA。以cDNA為模板，P1、P2互為引物 (表1)，PCR擴增人HSP27基因。PCR產物經EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，與酶切后的pCMV-Myc、pcDNA3-Flag、pGEX-4T-2載體連接，轉化E. coliDH5α感受態細胞，挑取陽性克隆，經北京博邁德生物科技有限公司測序獲得重組子質粒。

1.2.2 HSP27磷酸化突變體表達載體的構建

以 pcDNA3-Flag-HSP27質粒為模板，P3、P4互為引物，采用點突變試劑盒，構建獲得第78、82位絲氨酸突變為丙氨酸的HSP27雙突變體質粒。以該雙突變體質粒為模板，P5、P6互為引物，構建獲得第 15、78、82位絲氨酸突變為丙氨酸的HSP27磷酸化突變體。

1.2.3 NS1表達載體的構建

取流感病毒A/WSN/33毒株，Trizol法提取病毒RNA，以病毒RNA為模板進行RT-PCR獲得病毒 cDNA。以 cDNA為模板，P7、P8互為引物 (表1)，PCR擴增NS1基因。PCR產物經EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，與酶切后的pCMV-Myc、pcDNA3-Flag載體連接；以 P9、P10互為引物(表1) 同上述步驟酶切，與酶切后的pET28a載體連接。將連接產物轉化E. coliDH5α感受態細胞，挑取陽性克隆，經北京博邁德生物科技有限公司測序獲得重組子質粒。

表1 克隆HSP27、HSP27突變體以及NS1基因的引物Table 1 Primers for cloning of HSP27, HSP27-mutants and NS1

1.2.4 細胞培養與轉染

293T細胞在含有 10%胎牛血清，10 000 U/mL青霉素和鏈霉素的 DMEM 培養基中貼壁生長，培養環境為37 ℃，5% CO2。將細胞接種于培養板中，待細胞密度為60%～80%后，進行轉染。轉染前1～2 h，為細胞更換新鮮培養基。采用PEI為轉染試劑，根據實驗要求，轉染不同劑量的質粒于細胞中。轉染后6～8 h更換培養基，培養約36 h后，使用細胞裂解液 (0.5%NP40，150 mmol NaCl，20 mmol Hepes pH 7.4，10%甘油，1 mmol EDTA，加入蛋白酶抑制劑cocktail) 裂解細胞并離心收集上清液，進行后續檢測。

1.2.5 Western blotting檢測

將收獲的細胞上清液進行SDS-PAGE電泳，采用半干法將蛋白轉移至 PVDF膜上。封閉液(5%脫脂奶粉、1% BSA) 室溫封閉2 h。然后加入一定比例稀釋的一抗，室溫結合 1 h，TBST(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.05%Tween20) 洗3遍；加入一定比例稀釋的HRP標記二抗，室溫結合45 min，TBST洗3遍。采用底物顯色試劑盒進行X-ray曝光顯影。

1.2.6 免疫共沉淀 (Co-IP)

接種293T細胞于10 cm細胞培養皿中，共轉染 pCMV-Myc-HSP27與 pcDNA3-Flag-NS1，或pCMV-Myc-HSP27與pcDNA3-Flag于兩皿細胞中，每種質粒3 μg。轉染后36 h，使用1 mL細胞裂解液裂解細胞并收集上清液。加入anti-Flag-M2-agarose于上清液中，4 ℃孵育2 h，充分洗去雜蛋白，進行Western blotting檢測。

1.2.7 GST-pull down

將分別轉化 pET28a-NS1與 pGEX-4T-2-HSP27質粒的E. coliBL21培養至OD≈0.5～0.6，100 μg/mL IPTG誘導，16 ℃過夜培養。鎳柱純化His-NS1蛋白，sepharose 4B-glutathione純化GST-HSP27蛋白。取 1 μg 結合于 sepharose 4B-glutathione上的GST-HSP27及GST蛋白，加入1 μg His-NS1蛋白，4 ℃孵育2 h，充分洗去雜蛋白，進行Western blotting檢測。

1.2.8 免疫熒光檢測HSP27和NS1的共定位

接種293T細胞于鋪有玻片的24孔板中，將pcDNA3-Flag-HSP27與pCMV-Myc-NS1質粒各0.3 μg共同轉染293T細胞。轉染后約36 h，使用4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min，然后用含有4% BSA的TBST (PBS中加入0.5% Triton X-100) 室溫封閉1 h。加入一定比例稀釋的兔抗Myc、鼠抗Flag作為一抗，37 ℃結合1 h；PBST洗5次，每次10 min。然后加入一定比例稀釋的熒光二抗，37 ℃結合1 h；PBST洗5次，每次10 min。加入DAPI室溫染色5 min，PBST洗3次。然后在蓋玻片上滴一滴封片液 (50%甘油，50% PBS)，以指甲油封閉四周。激光共聚焦顯微鏡觀察HSP27和NS1在細胞中的定位情況。

1.2.9 熒光素酶報告基因檢測HSP27及NS1蛋白對于IFN-β表達的影響

接種 293T細胞于 24孔板中，每孔中轉染pIFN-β-luc 0.25 μg、pCMV-β-gal 0.1 μg 及不同實驗中所需質粒和對照質粒。轉染后36 h，更換為無血清DMEM，并加入SeV刺激細胞，6 h后，裂解并收集細胞，以β-gal作為內參，檢測細胞的luciferase活性。

1.2.10 熒光素酶報告基因檢測 HSP27對于RLH通路中各因子的影響

接種 293T細胞于 24孔板中，共轉染pIFN-β-luc 0.25 μg 、 pCMV-β-gal 0.1 μg 、pcDNA3-Flag-HSP27 或 pcDNA3-Flag 0.2 μg，RLH通路中各因子質粒 (pEF-Flag-RIG-IN、pEF-Flag-mda-5H、pcDNA3.1/Zeo-MAVS、pcDNA3.1-Flag-TBK1、pIRES-hrGFP-IRF3/5D)各0.2 μg。轉染后36～48 h，裂解并收獲細胞，以β-gal作為內參，檢測細胞的luciferase活性。

2 結果

2.1 HSP27蛋白的原核及真核表達

將轉化有pGEX-4T-2-HSP27的E. coliBL21培養并經 IPTG誘導后，離心并收集菌體，SDS-PAGE檢測 GST-HSP27蛋白的表達。結果顯示，在約53 kDa處有一條明顯的蛋白條帶，與GST-HSP27大小一致 (圖2A)。將pCMV-Myc-HSP27與pcDNA3-Flag-HSP27轉染293T細胞，36 h后收獲細胞，Western blotting可檢測到HSP27的表達 (圖2B、2C)。

2.2 HSP27和NS1能夠相互結合

將pCMV-Myc-HSP27與pcDNA3-Flag-NS1質粒轉染293T細胞，采用anti-FLAG-M2-agarose結合Flag-NS1，免疫共沉淀檢測HSP27和NS1蛋白的相互作用。如圖 3A所示，在同時轉染HSP27和 NS1的細胞裂解液中，能夠檢測到HSP27蛋白，說明HSP27和NS1在細胞內水平存在相互作用。

采用IPTG誘導E. coliBL21 pGEX-4T-2-HSP27、pET28a-NS1，表達并純化 GST-HSP27及His-NS1蛋白，GST-pull down結果顯示，在HSP27和 NS1蛋白同時存在的體系中，可檢測到HSP27與NS1的相互作用，即二者在細胞外水平能夠直接結合 (圖3B)。

在293T細胞中共轉染pcDNA3-Flag-HSP27與pCMV-Myc-NS1質粒后，免疫熒光檢測HSP27和NS1的定位。激光共聚焦顯微鏡的觀察結果顯示，Flag-HSP27主要定位于細胞質中，Myc-NS1在細胞質與細胞核中都有分布，兩者在細胞質中存在一定的共定位 (圖3C)。

圖2 HSP27蛋白在原核及真核細胞中的表達Fig.2 Expression of HSP27 in prokaryotic and eukaryotic cells. (A) Expression of GST-HSP27 inE. coliBL21. M:protein marker; 1:E. coliBL21 before induction: 2:E. coliBL21 after induction. (B, C) Expression of Myc-HSP27 and Flag-HSP27 in 293T cells.

圖3 HSP27和NS1的相互作用檢測Fig.3 Interactions of HSP27 and NS1 bothin vivoandin vitro. (A) Co-immunoprecipitation of Myc-HSP27 and Flag-NS1 in 293T cells. (B) GST-pull down assay of GST-HSP27 and His-NS1. (C) The co-localization of Flag-HSP27 and Myc-NS1 in transfected 293T cells detected by immunofluorescence assay.

2.3 HSP27抑制細胞中IFN-β的表達

將質粒 pIFN-β-luc、pCMV-β-gal、pCMVMyc-HSP27 (0.05、0.1、0.2、0.4 μg) 同時轉染293T細胞，36 h后采用SeV刺激，6 h后收獲細胞，檢測細胞的β-gal及luciferase活性。如圖4A所示，和轉染空質粒相比，在過表達 HSP27的細胞中，IFN-β的表達水平有所下降，且隨著HSP27轉染劑量的增加，下降程度逐漸增加。

HSP27具有15、78、82位3個絲氨酸磷酸化位點，細胞中 HSP27功能的發揮常與其磷酸化過程相關，但其3個絲氨酸磷酸化位點所各自具有的功能仍不清楚[16]。為了檢測 HSP27磷酸化對 IFN-β的影響，將其第 15、78、82位絲氨酸同時突變為丙氨酸，構建 HSP27磷酸化突變體。然后將質粒 pIFN-β-luc、pCMV-β-gal、磷酸化突變體 pcDNA3-Flag-HSP27-mutant或野生型pcDNA3-Flag-HSP27同時轉染293T細胞。如圖4B所示，HSP27磷酸化突變體和野生型相比，對于IFN-β的抑制程度并沒有顯著差別，說明磷酸化并不影響HSP27對于IFN-β的抑制作用。

圖4 HSP27及其磷酸化對于細胞中IFN-β表達的影響Fig.4 Effect of wild type HSP27 and mutant HSP27 on the expression of IFN-β. (A) Luciferase activities of 293T cells transfected with different doses of pCMV-myc-HSP27 were measured (A, upper). Both the expression and the relative protein levels of different doses of Myc-HSP27 were analyzed (A, middle and bottom). (B) Luciferase activities of 293T cells transfected with wild type and mutant HSP27 were measured (B, upper). The expression of both the wild type and mutant HSP27 were detected (B, bottom). The data of (A) and (B) is based on the results of three independent experiments, and error bars represent the standard deviation (n=3).

2.4 HSP27與NS1共同對于IFN-β的表達具有疊加抑制作用

將293T細胞分為6組，分別轉染0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μg pCMV-Myc-NS1，同時轉染 pIFN-β-luc、pCMV-β-gal，每組內又分為兩小組，分別轉染 pcDNA3-Flag-HSP27與pcDNA3-Flag。36 h后SeV感染，6 h后收獲細胞，檢測β-gal及luciferase活性。結果表明，隨著轉染劑量的增加，NS1對于IFN-β的抑制水平不斷加大，在 HSP27存在的條件下，對 IFN-β具有更強的抑制效果，表明 HSP27和 NS1對IFN-β具有疊加抑制作用。在低劑量轉染NS1時，該疊加效果較明顯；在 NS1轉染劑量較高時，HSP27發揮的疊加效果較弱 (圖5)。

圖5 HSP27與NS1共同對于IFN-β表達的影響Fig.5 The relationship of HSP27 and NS1 on the expression of IFN-β. (A) Luciferase activities of 293T cells transfected with different doses of NS1 together with HSP27. The data is based on the results of three independent experiments, and error bars represent the standard deviation (n=3). (B) Expression and relative protein levels of different doses of NS1 in transfected cells were analyzed. (C) Expression of HSP27 in transfected cells. 1: cells transfected with pcDNA3-FLAG; 2: cells transfected with pcDNA3-FLAG-HSP27. 1: cell transfected with pcDNA3-FLAG; 2: cell transfected with pcDNA3-FLAG-HSP27.

2.5 HSP27可能通過MDA5抑制IFN-β的表達

NS1可與RLH通路中RIG-I結合，抑制下游 IFN-β的表達。為了闡明 HSP27抑制 IFN-β的機理，將質粒 pEF-Flag-RIG-IN、pEF-Flagmda-5H、pcDNA3.1/Zeo-MAVS、pcDNA3.1-Flag-TBK1、pIRES-hrGFP-IRF3/5D 分別轉染293T細胞，表達出RLH通路中RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IRF3的活性蛋白，同時轉染pIFN-β-luc、pCMV-β-gal、pcDNA3-Flag-HSP27或 pcDNA3-Flag，然后檢測細胞中的 luciferase活性。結果顯示，在轉染RIG-I、MAVS、TBK1、IRF3的細胞中，同時過表達 HSP27對于細胞IFN-β的表達均沒有顯著影響；在轉染MDA5的細胞中，HSP27對于IFN-β的表達水平具有顯著抑制作用，說明HSP27可能通過MDA5而抑制IFN-β 的表達 (圖 6A、6B)。

圖6 HSP27對RLH通路中各因子的影響Fig.6 Analysis of target proteins of HSP27 in the RLH pathway. (A) 293T cells were transfected with different factors of RLH pathway, and luciferase activities were compared between HSP27 and mock of each factor. The data is based on the results of three independent experiments, and error bars represent the standard deviation (n=3). **P<0.01 byttest.(B) Detection of expression levels of HSP27.

3 討論

HSP27作為一種具有多重功能的蛋白在多種病毒的感染周期中都發揮重要作用[16]。例如，HSP27的過表達及MK2/HSP27途徑的激活可增強腺病毒粒子從胞質到細胞核的轉運，促進腺病毒的感染[23]；呼吸道合胞病毒RSV對于細胞的感染常伴隨著 HSP27磷酸化水平的增加，且磷酸化的 HSP27可促進病毒的復制[24]；在 HSV-1感染后，細胞中 HSP27可迅速磷酸化，改變細胞定位，并促進病毒復制[25]。雖然在流感病毒粒子中可檢測到HSP27[21]，但其在病毒生命周期中所起的作用尚不清楚。研究表明，HSP27可和流感病毒蛋白互作，并且通過功能試驗，檢測了HSP27在流感病毒感染中可能發揮的功能。

據報道，HSP27可拮抗HIV-1 Vpr蛋白的活性，抑制病毒復制[26]。流感病毒的 NS1蛋白和HIV-1 Vpr蛋白具有相似的細胞定位及功能，因此，本實驗首先檢測了HSP27和NS1的相互作用。通過Co-IP、GST-pull down、免疫熒光，我們證實，HSP27和 NS1在細胞內及細胞外水平都能夠相互結合，而且在細胞質中存在共定位。

Ⅰ型干擾素的產生是抗病毒免疫反應的一個重要方面，細胞主要通過 Toll樣受體 (TLR)途徑及RIG-I樣RNA解旋酶 (RLH) 途徑來識別病毒[27]。而流感病毒NS1蛋白可在RLH途徑中發揮作用，它可和 RIG-I結合，進而干擾下游MAVS、IRF3的激活，最終影響IFN-β啟動子的激活，抑制IFN-β的產生[13]。由于HSP27和NS1存在相互作用，因此HSP27是否影響IFN-β的表達是我們需要探究的重要問題。

研究表明，HSP27以劑量依賴型式抑制病毒感染細胞中的IFN-β表達，而且不依賴于其磷酸化狀態，即磷酸化并不影響 HSP27對于 IFN-β表達的抑制，因此推測這種抑制作用是由HSP27本身具有的性質來介導的，如分子伴侶活性，具體機制仍需進一步驗證。由于NS1的一項重要功能即是抑制病毒感染細胞中的IFN-β表達，實驗結果表明，HSP27可以和 NS1對于IFN-β的抑制作用疊加，更大程度抑制IFN-β的表達，但是由于NS1本身對于IFN-β的抑制作用非常明顯，而且在病毒感染早期NS1蛋白大量表達，因此這種疊加效果比較有限，在NS1劑量較低時較為顯著。另外，我們發現HSP27可能通過MDA5來發揮對于IFN-β的抑制作用，但這種抑制作用的具體機制，即HSP27可否通過影響MDA5上游對于病毒RNA的識別或下游對于MAVS等因子的招募而最終影響 IFN-β的表達仍需進一步的實驗。

綜上所述，研究結果表明 HSP27蛋白可參與流感病毒感染后細胞內的天然免疫過程，對于進一步了解宿主因子對于流感病毒的調節機制以及病毒感染細胞中天然免疫反應具有一定的指導意義。

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Heat shock protein 27 enhances the inhibitory effect of influenza A virus NS1 on the expression of interferon-β

Zheng Li1,2, Xiaoling Liu1, Zhendong Zhao1,2, and Wenjun Liu1

1CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China
2Graduated University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China

李錚, 劉曉玲, 趙振東, 等. 熱休克蛋白27增強A型流感病毒NS1對β干擾素的抑制作用. 生物工程學報, 2012, 28(10):1205?1215.

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Received:April 9, 2012;Accepted:May 7, 2012

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 81101253), National Basic Research Program of China (973 Program) (No.2012CB955501-06).

Corresponding author:Wenjun Liu. Tel: +86-10-64807497; Fax: +86-10-64807503; E-mail: liuwj@im.ac.cn

國家自然科學基金 (No. 81101253)，國家重點基礎研究發展計劃 (973計劃) (No. 2012CB955501-06) 資助。