成骨不全癥血清中骨相關microRNAs的初步篩查

王子強，魯艷芹，任秀智，王延宙，李志良，徐超，韓金祥

1 山東省醫(yī)學科學院 山東省醫(yī)藥生物技術研究中心，山東 濟南 250062

2 天津醫(yī)院，天津 300211

3 山東省省立醫(yī)院，山東 濟南 250033

4 武清區(qū)人民醫(yī)院，天津 301700

生物技術與方法

成骨不全癥血清中骨相關microRNAs的初步篩查

王子強1，魯艷芹1，任秀智2，王延宙3，李志良4，徐超1，韓金祥1

1 山東省醫(yī)學科學院 山東省醫(yī)藥生物技術研究中心，山東 濟南 250062

2 天津醫(yī)院，天津 300211

3 山東省省立醫(yī)院，山東 濟南 250033

4 武清區(qū)人民醫(yī)院，天津 301700

旨在初步篩選出成骨不全癥 (Osteogenesis imperfecta，OI) 患者血清中差異表達的骨相關microRNAs(miRNAs)，通過探討其在該疾病中的可能作用，為進一步研究成骨相關miRNA的功能及miRNA在成骨不全癥診斷中的應用奠定基礎。首先用geNorm和NormFinder等程序挑選出適于血清miRNAs定量檢測的內參基因，然后利用實時熒光定量PCR技術對miRanda，Targetscan和Pictar軟件以及文獻報道篩選出的骨形成相關miRNAs進行定量檢測，最后用配對t檢驗統(tǒng)計學方法篩查出差異表達的骨相關miRNAs。結果顯示6個候選內參基因在不同年齡、性別和用藥情況的成骨不全癥患者和健康個體血清中的表達穩(wěn)定性良好 (表達穩(wěn)定值M<1.5)，后經(jīng)標準化因子配對差異 (Pairwise variations) 分析確定最適內參數(shù)目為 4個 (配對差異值V4/5=0.133<0.15)，分別是 miR-16、Let-7a、snRNAU6、miR-92a。通過在 16個成骨不全癥患者以及 8個健康對照個體的血清中進一步檢測 miR-16、Let-7a、snRNAU6和 miR-92a，發(fā)現(xiàn)其表達穩(wěn)定性依然良好 (M<1.5)。對100余種骨相關 miRNAs進行實時熒光定量檢測，發(fā)現(xiàn) 11種 miRNAs在成骨不全癥患者血清中有差異表達(P<0.05)，并且生物信息學分析顯示這些差異表達的miRNAs 很可能在成骨不全癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。以上實驗結果表明成骨不全癥患者血清中存在多種差異表達的骨相關miRNAs，而且這些miRNAs很可能成為一種用于成骨不全癥血清學檢查及診斷的生物標志物。

成骨不全癥，血清miRNAs，內參基因，生物標志物

Abstract:We screened differential expression bone-related microRNAs (miRNAs) in serum of patients with osteogenesis imperfect (OI). First, we selected the reference gene (s) fit for quantitative detection of serum miRNAs by using geNorm and several other programmes. Then real-time fluorescent quntitative PCR was used to detect the expression level of bone-related miRNAs gained by means of miRanda, Targetscan and Pictar softwares caculation and reading literature.Then, the results were analyzed with the matched t test. All 6 candidate reference genes had a stable expression level in serum of healthy controls and patients with different characters, and the optimal number of reference genes is 4 (miR-16,let-7a, snRNAU6, miR-92a) after Pairwise Variations analysis (V4/5=0.133<0.15). For validating the universality of expression stability, we detected the relative expression value of miR-16, let-7a, snRNAU6 and miR-92a in another 8 healthy controls and 16 patients with OI and the result revealed that the expression of 4 genes remained stable (M<1.5).After measuring serum levels of more than 100 bone-related miRNAs in patients with real-time qPCR, 11 miRNAs showed differential expression, and bioinformatic analysis suggested these altered expressional mioRNAs had possibilities to participate in the process of OI. So the experiment indicated that there existed many differential expression bone-related miRNAs in serum of patients with OI, and these miRNAs had potentials to be promising biomarkers for serologic tests and diagnosis of OI.

Keywords:osteogenesis imperfecta, serum miRNAs, reference gene, biomarker

成骨不全癥是一種在骨形成過程中以成骨細胞增殖分化異常和破骨細胞活性異常為特征的罕見異常性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，雙磷酸鹽藥物可以通過調節(jié)某些 miRNAs的表達水平來促進成骨細胞的增殖和抑制破骨細胞活性，進而緩解癥狀[1]。然而對于miRNAs的異常表達是否參與了成骨不全癥的發(fā)生發(fā)展過程以及血清學檢查miRNAs能否作為對成骨不全癥的診斷依據(jù)，至今未有定論。

miRNAs是一種長約 22 nt的非編碼單鏈RNA，通過和靶基因mRNA 3￠非翻譯區(qū)序列互補結合抑制其翻譯，有人推測人類約有1/3的基因受miRNAs的調控。隨著對miRNAs功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)miRNAs不僅可以參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，而且對骨的發(fā)生過程有重要的調節(jié)作用[2]。另外，miRNAs不僅可以調節(jié)細胞內基因的表達水平，也可以在外周血中發(fā)揮其生物學作用。目前已知，血清miRNAs在體內免疫以及一些血液性疾病中都發(fā)揮重要作用[3-4]，并且，其表達水平與疾病的發(fā)生發(fā)展階段有緊密聯(lián)系[5]，提示血清 miRNAs很有可能成為一種新型的疾病生物標志物用于疾病預測與診斷。

為了深入研究 miRNAs在成骨不全癥發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究通過檢測成骨不全癥患者血清中差異表達的骨相關miRNAs，試圖找到一種或幾種能表征該疾病的標志miRNAs，為研究骨相關miRNAs的功能以及miRNAs在成骨不全癥的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

Trizol LS試劑購自Invitrogen公司；miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和 miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒購自 TIANGEN公司；引物序列參照 QIAGEN 公司網(wǎng)站(https://www.qiagen.com/geneglobe/default.aspx)推薦序列并由華大基因合成。

1.2 儀器

NanoDrop2000c紫外/分光光度計購自Thermo Fisher Sientific公司；LightCycler 480購自Roche公司。

1.3 血液樣本

病例組 (Patients group，PG) 血液樣本采自天津醫(yī)院和山東省省立醫(yī)院確診的 22名成骨不全癥患者的清晨空腹靜脈血，男女性別比例8∶3，年齡為 (9.54±3.65) 歲。10名對照組 (Control group，CG) 的血液樣本取自本市大佛小學志愿者的清晨空腹靜脈血，男女比例 6∶4，年齡為(8.20±0.42) 歲。全部血液樣本均在2 h內完成離心與分裝。

1.4 血清總RNA提取

抽取的新鮮血液樣本經(jīng)1 900×g離心10 min后，取200 μL上清于新的預冷離心管中。向離心管中加入750 μL Trizol LS試劑，充分混勻后室溫靜置5 min。加入200 μL三氯甲烷，漩渦振蕩30s后再室溫靜置5 min。4 ℃、12 000×g離心15 min，取其上清于另一預冷離心管中，并向其管中加入600 μL異丙醇，上下顛倒混勻后，室溫靜置 10 min。4 ℃、12 000×g離心 10 min，棄液相，沉淀用75%乙醇洗滌2次后溶于15 μL去RNA酶水中。RNA樣本質量由2%瓊脂糖凝膠和NanoDrop2000c紫外/分光光度計進行評估。

1.5 反轉錄及實時熒光定量PCR

按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒操作方法，對各樣品總RNA進行反轉錄，反轉錄產(chǎn)物可直接用于下游反應或?20 ℃貯藏備用。實時熒光定量 PCR反應是根據(jù) SYBR Green I嵌合熒光法的原理利用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒完成的。反應體系為：2×miRcute miRNA預混合液5 μL；上游引物0.2 μL；下游引物0.2 μL；miRNA第一鏈cDNA 1 μL；DEPC-H2O 3.6 μL。總反應體系為 10 μL，每個樣品重復3次。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 20s，60 ℃退火 20s，72 ℃延伸 20s，共45個循環(huán)。將LightCycler 480讀取的CT值利用 Q=EΔCT，計算出各基因的相對表達量 Q，后經(jīng)內參基因標準化因子處理用于數(shù)據(jù)分析，其中E為PCR擴增效率。

1.6 內參基因的選擇及驗證

選擇在性別、年齡、用藥情況差異較大的6名OI患者和2名健康個體人作為研究對象，選取 miR-16、miR-92a、miR-638、Let-7a、snRNAU6以及18S rRNA作為候選內參基因，其中miR-16、miR-638、snRNAU6和 18S rRNA是外周血miRNAs實時定量檢測常用的內參，miR-92a和Let-7a是在前期預實驗中發(fā)現(xiàn)的較穩(wěn)定表達的基因。然后應用實時熒光定量 PCR技術以及geNorm和NormFinder等程序對6種候選內參基因進行表達穩(wěn)定性分析，選出最優(yōu)內參基因組合，最后在另外16個OI患者和8個健康對照個體血清中驗證其表達穩(wěn)定性，并計算出內參基因的標準化因子。

1.7 骨相關miRNAs的差異表達篩查

選取在成骨細胞和破骨細胞增殖分化過程中起重要作用的相關蛋白，后用 miRanda、Targets和 Pictar軟件找到能和靶蛋白 mRNA 3￠非編碼區(qū)互補結合的miRNAs，取其交集，加之文獻已經(jīng)報道的在骨發(fā)生過程中有調節(jié)功能的miRNAs確定待檢骨相關 miRNAs。選取沒有藥物治療史的8名成骨不全癥患者血清和以性別、年齡相配比的 8名健康人血清作為實驗研究對象，利用熒光定量 PCR技術對待檢骨相關miRNAs進行定量檢測，最后用配對t檢驗統(tǒng)計學方法篩選出OI患者血清中差異表達的骨相關miRNAs。

2 結果與分析

2.1 內參基因的選擇及驗證

geNorm程序對內參基因表達穩(wěn)定性分析時，通常建議基因表達穩(wěn)定值M＜1.5即可認為其表達穩(wěn)定性較好，并且 M 值越小，穩(wěn)定性越高。本實驗經(jīng)geNorm程序分析顯示，6個候選內參基因的M值都小于1.5，且其表達穩(wěn)定性從大到小依次為snRNAU6/miR-92a (0.5228)、miR-16(0.6783)、Let-7a (0.7215)、18S rRNA (0.7708)、miR-638 (0.8617) (圖1)。最適內參數(shù)目分析結果顯示V4/5=0.133＜0.15 (geNorm程序默認0.15為取舍值)，即最適合內參數(shù)目為 4個，分別為snRNAU6、miR-92a、miR-16 和 Let-7a (圖 2)。用normFinder、Bestkeeper、delta CT軟件程序分析基因表達穩(wěn)定性顯示結果和geNorm程序分析結果一致，并且用geNorm軟件程序對篩選出的4個內參在另外16個成骨不全癥患者和8個健康對照個體血清中的表達穩(wěn)定性進行驗證，結果顯示，4個內參基因表達穩(wěn)定性依然良好 (圖3)。

圖1 6個候選內參基因的表達穩(wěn)定值Fig.1 Expression stability values of 6 candidate reference genes.

圖2 最適內參基因的數(shù)目Fig.2 Determination of the optimal number of reference genes for normalization.

圖3 4個內參基因在8個健康個體和16個成骨不全癥患者血清中的表達穩(wěn)定值Fig.3 Expression stability values of 4 reference genes in serum of 8 healthy controls and 16 patients with OI.

2.2 骨相關miRNAs的差異表達篩查

對116種骨相關miRNAs進行實時熒光定量檢測，發(fā)現(xiàn)有11種miRNAs (miR-34c，miR-29a，miR-29b，miR-489，miR-133a，miR-145，miR-210，miR-1297，miR-26a，miR-30e，miR-21) 在成骨不全癥血清中出現(xiàn)差異表達 (P＜0.05)，其中miR-26a、miR-30e、miR-21為上調 (圖 4)。通過比較的差異倍數(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-29a和miR-133a變化幅度最大，分別是下調了12.80和6.31倍，變化最小的是下調了0.75倍的miR-145，除此之外，其余miRNAs的變化倍數(shù)均在1.5～4之間。另外，miR-29a在病例組血清中的相對表達量普遍低于對照組 (圖 5)，而 miR-26a普遍高于對照組(圖 6)。

圖4 11個差異表達的骨相關miRNAs在健康個體和成骨不全癥患者血清中的表達情況Fig.4 Differential expression levels of eleven serum miRNAs in healthy controls and patients with OI.

圖5 miR-29a在健康個體和成骨不全癥患者血清中的表達情況Fig.5 Expression level of serum miR-29a in healthy controls and patients with OI.

圖6 miR-26a在健康個體和成骨不全癥患者血清中的表達情況Fig.6 Expression levels of serum miR-26a in healthy controls and patients with OI.

3 討論

實時熒光定量 PCR是一種能高效地實時檢測某種基因 mRNA表達水平的技術，目前已在實驗室普遍使用，但也存在諸多問題，最突出的問題就是內參基因的選擇。研究顯示，沒有一種基因是穩(wěn)定表達的，單一利用一種看家基因對實驗數(shù)據(jù)進行標準化，可以造成幾十倍以上的差異[6]。本實驗利用Vandesompele在2002年編寫的一款geNorm程序篩選出4種較高表達穩(wěn)定性的基因作為實時熒光定量檢測的內參基因。為驗證geNorm程序分析結果的準確性以及4種內參基因穩(wěn)定穩(wěn)定的普遍性，本實驗又通過normFinder、Bestkeeper、Delta CT method 等程序以及擴大樣本量的方法對4種基因進行了進一步的分析，結果顯示，snRNAU6、miR-92a、miR-16和 Let-7a在實驗組和對照組的血清中都有較好的表達穩(wěn)定性，為后續(xù)試驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性提供了有力的證據(jù)。四個內參基因中，miR-16是外周血檢測miRNAs最常用的內參基因，迄今應用于多種疾病的研究，如胃癌[7]、前列腺癌[8]、乳腺癌[9]和肝癌[10]等癌癥。snRNAU6是一種在細胞內穩(wěn)定表達的核糖體 RNA，近年來也發(fā)現(xiàn)在多種疾病的外周血中能穩(wěn)定表達，如結腸直腸癌的血漿，乳腺癌的血清口腔鱗狀細胞癌的血漿以及膀胱癌的尿液中[10]。但未見 miR-92a和Let-7a的相關報道。

在篩選出的11種miRNAs中，有些因在多種腫瘤的血清中都能檢測到其差異表達而被稱為“腫瘤miRNA”，如miR-21，已被多種腫瘤疾病[11-16]作為潛在的生物標志物用于臨床疾病預測及診斷，另外幾種 miRANs (miR-210，miR-133a，miR-26a，miR-29a，miR-34c) 也多在一些腫瘤[17-25]的血清中檢測到差異變化。雖然沒有在骨相關疾病血清中存在差異表達的相關報道，但有不少關于這些miRNAs在細胞中影響骨形成過程的研究。已知miR-29b可以促進成骨細胞分化，其機制是和組蛋白去乙酰化酶4，轉化生長因子 β3，人連環(huán)蛋白-β互動蛋白1等成骨細胞分化抑制基因的 3￠非編碼端互補結合并抑制其表達[26]，另外，miR-29a[27]和 miR-210[28]也可分別通過抑制基因Dikkopf-1和1B型激活素A受體的翻譯來促進成骨細胞分化。在抑制成骨細胞分化方面，miR-34c[29]、miR-133a[30]和miR-489[31]是分別通過抑制轉錄因子runx2，鈣結合蛋白grancalcin、和轉錄因子runx2的基因表達來實現(xiàn)的。其他幾種 miRNAs，除了 miR-21有促進破骨細胞分化的作用外，其余未見相關報道。但是經(jīng)miRanda、PicTar、TargetScan三種軟件分析靶基因發(fā)現(xiàn)，miR-145、miR-30e和miR-1297不僅可以影響一些經(jīng)典的骨相關信號通路如Wnt、ERK/MEK、Hedgehog去調節(jié)骨形成過程，還可以直接作用于細胞的增殖與凋亡，所以預測這些骨相關 miRNAs在細胞中也可能存在差異表達變化并且變化程度和血清中的相符合。

總之，本研究篩選出了4種在成骨不全癥患者和健康個體血清中都能穩(wěn)定表達的內參基因snRNAU6、miR-92a、miR-16和 Let-7a，并且通過生物信息學分析認為初步篩查出的 11種差異表達的骨相關 miRNAs很有可能作為一種生物標志物用于成骨不全癥的診斷與研究。

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Screening of bone-related microRNAs in serum of patients with osteogenesis imperfect

Ziqiang Wang1, Yanqin Lu1, Xiuzhi Ren2, Yanzhou Wang3, Zhiliang Li4, Chao Xu1, and Jinxiang Han1

1Shandong Medicinal Biotechnology Center,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan250062,Shangdong,China
2Tianjin Hospital,Tianjin300211,China
3Shandong Provincial Hospital,Jinan250033,Shangdong,China
4Wuqing People's Hospital,Tianjin301700,China

王子強, 魯艷芹, 任秀智, 等. 成骨不全癥血清中骨相關microRNAs的初步篩查. 生物工程學報, 2012, 28(10): 1245?1252.

Wang ZQ, Lu YQ, Ren XZ, et al. Primary screening of bone-related microRNAs in serum of patients with osteogenesis imperfecta. Chin J Biotech, 2012, 28(10): 1245?1252.

Received:March 17, 2012;Accepted:April 17, 2012

Supported by:National Key Technology R&D Program (No. SQ2011SF12C03081).

Corresponding author:Jinxiang Han. Tel: +86-531-82919888; E-mail: samshjx@sina.com

國家科技支撐計劃 (No. SQ2011SF12C03081) 資助。