建立分泌型熒光素酶基因標記的原位肝癌模型及用于干擾素β基因治療評價

王剛，連忠輝，田文洪,，董小巖，尉遲捷，吳小兵,4

1 中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所，北京 100052

2 吉林大學 生命科學學院，吉林 長春 130012

3 北京五加和分子醫學研究所，北京 100176

4 北京亦莊國際生物醫藥投資管理有限公司，北京 100111

生物技術與方法

建立分泌型熒光素酶基因標記的原位肝癌模型及用于干擾素β基因治療評價

王剛1，連忠輝2，田文洪1,2，董小巖3，尉遲捷1，吳小兵1,4

1 中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所，北京 100052

2 吉林大學 生命科學學院，吉林 長春 130012

3 北京五加和分子醫學研究所，北京 100176

4 北京亦莊國際生物醫藥投資管理有限公司，北京 100111

旨在建立一種分泌型熒光素酶基因標記的小鼠原位移植型肝癌模型并觀察其對干擾素 β基因治療的反應。首先建立穩定表達分泌型熒光素酶Gluc (Gaussia princepsluciferase) 的小鼠肝癌細胞Hepa 1-6/Gluc;將該細胞通過脾注射至C57BL/6小鼠肝臟建立原位移植型肝癌模型，通過檢測外周血Gluc活性監測小鼠體內腫瘤生長情況；用此模型觀察水動力注射干擾素β質粒DNA的抗腫瘤效果。結果表明，通過脾注射Gluc基因標記的Hepa 1-6細胞可以建立小鼠原位移植型肝癌模型;外周血Gluc活性可以有效反映體內接種腫瘤細胞的數量和腫瘤的生長情況;通過監測外周血Gluc活性可靈敏反映干擾素β基因治療對腫瘤生長的抑制作用。本研究表明，利用Gluc為報告基因建立的小鼠原位移植型肝癌模型可以體外實時監測腫瘤的生長情況，并能靈敏可靠地用于抗腫瘤治療效果的評價。

熒光素酶，Gluc，肝癌模型，IFN-β，基因治療

Abstract:To establish an orthotopic transplant mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) labeled with secretary luciferase and to study its response to anti-tumor treatment with interferon-β gene therapy. We labeled the murine hepatoma Hepa1-6 cells with secretaryGaussia princepsluciferase (Gluc), and then injected Gluc labeled Hepa1-6 cells intrasplenically in C57BL/6 mice. We monitored blood Gluc to evaluate the tumor development and anti-tumor effects of hydrodynamic injection with interferon-β expressing plasmid. We successfully established the orthotopic mouse model of HCC by intrasplenic injection of Gluc labeled Hepa1-6 cells. The Gluc blood assay could reflect the amount of cancer cellsin vivo, tumor progression, as well as anti-tumor effect of interferon-β gene therapy. In conclusion, Gluc labeled orthotopic transplant mouse model of HCC canex vivoreal-time monitor the tumor development and tumor response to treatments.

Keywords:luciferase, Gluc, model of hepatocellular carcinoma, IFN-β, gene therapy

肝細胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌) 是最為常見的肝臟原發惡性病變。動物肝癌模型是研究腫瘤體內生長、轉移以及抗腫瘤藥物開發的重要工具。通常情況下，模型體內腫瘤生長情況的監測是比較困難的，腫瘤需要生長到一定程度才能在體外觸及，往往需要在不同時間處死動物才能測量腫瘤大小，因此難以獲得連續的腫瘤生長數據。這為研究腫瘤的發生和發展，尤其給腫瘤治療效果的評價造成了不便。

Gluc是一種來自于海洋撓腳類動物Gaussia princeps的分泌型熒光素酶[1]，是一個理想的體外實時監測體內生物學過程的報告基因[2-3]。通過檢測外周血中的 Gluc已經實現了方便地監測接種在動物體內的神經膠質瘤、乳腺癌和肝母細胞瘤[2-5]。我們試圖建立以Gluc為報告基因的小鼠原位移植型肝癌模型，用以方便靈敏地體外實時監測體內腫瘤生長情況，并嘗試用這種模型實時監測和評價腫瘤治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

含有neo基因并以 CAG (Cytomegalovirus enhancer，chicken β-actin promoter，β-globin poly A signal) 為啟動子的 Gluc真核表達質粒pAAV2neo-CAG-Gluc、人干擾素 β (Interferon-β，IFN-β) 真核表達質粒 pAAV2neo-CAG-IFN-β 和增強型綠色熒光蛋白 (Enhanced green fluorescent protein，EGFP) 真核表達質粒 pAAV2neo-CAGEGFP由本室構建和保存。來源于C57L小鼠的肝癌細胞株Hepa 1-6購自美國ATCC，由本室保存。3～4周齡雄性C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司。質粒大提試劑盒購自德國Qiagen公司；DMEM培養基、胎牛血清和脂質體 Lipofectamine? 2000購自美國 Invitrogen公司；G418和戊巴比妥鈉購自北京欣經科生物技術有限公司；Gaussia熒光素酶檢測試劑盒購自美國NEB公司；VeriKine-HS? Human IFN-β ELISA檢測試劑盒購自美國PBL公司。

1.2 細胞培養、轉染和篩選

Hepa 1-6細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液于 5%的 CO2培養箱中培養。用脂質體lipofectamine? 2000按說明書將 pAAV2neo-CAG-Gluc質粒轉染Hepa 1-6細胞，用含G418(400 μg/mL) 的選擇性培養基培養15 d，獲得穩定表達Gluc的Hepa 1-6細胞 (Hepa 1-6/Gluc)。

1.3 細胞生長曲線和培養上清中 Gluc活性測定

取Hepa 1-6/Gluc細胞，接種于24 孔板，接種密度為5×103cell/孔，每天更換培養基。接種后1～8 d，每天取3孔細胞的培養上清，用PBS緩沖液稀釋100倍后取2.5 μL使用Gaussia 熒光素酶檢測試劑盒檢測，按照說明書進行操作，使用發光檢測儀收集 10s光信號并測定其相對光強度(Relative light units，RLU)。然后用胰蛋白酶消化上述3孔細胞，用血球計數板測定細胞數，并繪制細胞生長曲線。

1.4 脾注射法制備小鼠原位肝癌模型

取對數生長期的Hepa 1-6細胞，常規消化、吹打，盡量分散細胞。用 PBS緩沖液洗滌細胞兩次，并計數，最終用 PBS緩沖液稀釋成1×107cell/mL濃度的細胞懸液，置于4 ℃備用。取3～4周齡雄性C57BL/6小鼠，按照75 mg/kg劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉。小鼠右側臥位，固定于鼠板，常規消毒，于背側中部、左側腋中線與腋后線間剪開約0.5～0.8 cm左右切口，完全游離脾臟，用 30 G的胰島素注射器吸取100 μL 的 Hepa 1-6 細胞懸液 (1×106cell)，于脾臟上極沿脾臟縱軸進針，緩慢注入脾內，結扎脾蒂切除脾臟，全層縫合腹壁。

1.5 外周血Gluc活性檢測

小鼠接種Hepa 1-6/Gluc細胞后，尾靜脈采血2.5 μL，加入Gaussia 熒光素酶檢測試劑盒中的底物50 μL，使用發光檢測儀收集10s光信號并測定其相對光強度。

1.6 水動力法體內轉染IFN-β基因和EGFP基因并檢測其表達

取小鼠體重 10%的生理鹽水，將 10 μg的pAAV2neo-CAG-IFN-β 或 pAAV2neo-CAG-EGFP溶于其中，并于5～7 s內經小鼠尾靜脈快速注射入體內。尾靜脈采血，分離血清，用 VeriKine-HS? Human IFN-β ELISA檢測試劑盒按說明書操作檢測外周血 IFN-β水平。取小鼠肝臟制作冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察 EGFP在肝臟的表達。

1.7 腫瘤大體和病理

小鼠接種Hepa 1-6/Gluc細胞后不同時間，觀察腫瘤大體并照相，取腫瘤組織做石蠟切片，常規HE染色觀察病理形態。

2 結果

2.1 Gluc標記的Hepa 1-6細胞的鑒定

通過G418篩選獲得穩定表達Gluc的Hepa 1-6/Gluc細胞株，生長曲線 (圖 1A) 顯示 Hepa 1-6/Gluc細胞經歷了潛伏期、指數生長期并進入平臺期，細胞生長良好。24孔板中的細胞數目在8 d 的培養中從 (7.01±0.78)×103cell 增長至(1.15±0.15)×106cell，增殖了 164倍。細胞培養上清 Gluc檢測結果顯示 (圖 1B)，Gluc活性從(5.27±0.94)×104RLU 增長 至 (5.18±0.07)×106RLU，增長了98倍，Gluc監測曲線很好地體現出細胞生長的潛伏期、指數生長期和平臺期；Gluc活性與細胞數兩者均數之間具有極好的相關性 (R2=0.998) (圖 1C)。以上結果說明，Gluc能可靠、靈敏地反映體外培養Hepa 1-6/Gluc細胞的數量和生長情況。

2.2 Gluc標記小鼠原位肝癌模型的建立

將 1×105、3×105、1×106、3×106和 1×107cell的 Hepa 1-6/Gluc細胞通過脾注射接種至C57BL/6小鼠 (n=4)，在接種后2 h檢測外周血Gluc活性，觀察Gluc活性是否可靠反映接種細胞的數目。結果發現，1×105cell的Hepa 1-6/Gluc細胞接種即可在外周血檢測到 Gluc的表達，Gluc活性隨細胞接種量的增加而升高，1×107cell的細胞接種后可達到 (3.35±0.52)×104RLU；Gluc活性與接種細胞數具有很好的相關性(R2=0.925) (圖 2A)。

然后觀察了Hepa 1-6/Gluc細胞的成瘤性，1×106cell以上的Hepa 1-6/Gluc細胞脾注射均可造成 100%小鼠出現移植型肝癌。1×106cell的Hepa 1-6/Gluc細胞注射的小鼠在接種后5 d，肝表面出現肉眼可見的散在白色結節，多出現在肝緣部位。在接種后20 d，肝表面出現彌漫性的白色結節 (圖 2B)，除肝臟外，脾臟的注射部位也出現了白色結節 (圖2B)，其他臟器未見結節。

圖1 Gluc標記的Hepa 1-6細胞 (Hepa 1-6/Gluc) 的鑒定Fig.1 Identification of the Gluc labeled Hepa 1-6 cell (Hepa 1-6/Gluc). (A) Growth curve of the Hepa 1-6/Gluc cell.(B) Time-course data of the Gluc activities in the Hepa 1-6/Gluc cell culture supernatants. (C) Correlation of the cell culture supernatant Gluc activity to the Hepa 1-6/Gluc cell number.

然后用1×106cell的Hepa 1-6/Gluc細胞脾注射制作了小鼠原位肝癌模型并檢測了外周血Gluc活性的變化。由于Hepa 1-6/Gluc細胞在脾臟的生長會影響 Gluc監測肝臟腫瘤的準確性，因此我們在制作模型時將脾臟進行了切除。結果顯示 (圖 2C)，接種 2 h后外周血 Gluc活性為(1.01±0.16)×104RLU，接種 1 d 后下降至(8.29±1.4)×103RLU，從接種2 d起Gluc活性出現指數級升高，在18 d時達到 (6.28±1.16)×106RLU，指數增長期一直持續至18～21 d，隨后Gluc增長進入平臺期。模型動物從23 d出現死亡，存活期為 (27.00±2.92) d。

圖2 建立Gluc標記的原位移植型肝癌模型Fig.2 Establishment of the Gluc labeled orthotopic transplant model of HCC. (A) Correlation of the blood Gluc activity to the inoculated Hepa 1-6/Gluc cell number (n=4). (B) Tumor mass in the spleen (upper) and the liver (lower)20 d after intrasplenic injection of Hepa 1-6/Gluc cells. (C) Time-course data of the blood Gluc activity in five independent mouse models. (D) Tumor mass in the liver on 3 d, 7 d, 14 d and 21 d after intrasplenic injection of Hepa 1-6/Gluc cells. (E) Blood Gluc activities on 3 d, 7 d, 14 d and 21 d after intrasplenic injection of Hepa 1-6/Gluc cells.

為了探討外周血 Gluc水平能否反映肝臟腫瘤的生長情況，分別在1×106cell的Hepa 1-6/Gluc細胞接種后3 d、7 d、14 d和21 d，各取3只小鼠，觀察肝臟腫瘤大體，與外周血 Gluc活性進行對比。結果顯示 (圖2D，E)，在接種后3 d肝臟未形成明顯結節，但肝臟表面尤其肝緣部位出現蒼白色，外周血 Gluc值為 (1.90±0.50)×104RLU；接種后7 d肝臟表面出現十幾個至數十個不等的白色結節，肝緣部位有少量結節匯合成片，外周血Gluc值為 (1.91±0.64)×105RLU；接種后14 d肝臟表面出現大量白色結節，50%以上匯合成片，外周血 Gluc值為 (2.02±0.37)×106RLU；接種后 21 d肝臟表面出現彌漫性白色結節，幾乎不見正常肝組織，外周血 Gluc值為(8.79±1.27)×106RLU。上述結果顯示，外周血Gluc活性隨腫瘤的生長而升高，與腫瘤大體符合，可以客觀反映肝臟腫瘤的生長情況。

2.3 利用Gluc實時監測肝癌模型對干擾素β基因治療的反應

隨后我們對建立的肝癌模型進行了干擾素β的基因治療，小鼠接種 1×106cell的 Hepa 1-6/Gluc細胞后 5 d，通過尾靜脈水動力注射10 μg的 pAAV2neo-CAG-IFN-β 質粒 (n=5) 和對照質粒 pAAV2neo-CAG-EGFP (n=5)，探討通過監測外周血 Gluc水平能否可靠反映抗腫瘤治療的效果。

首先檢測了EGFP和IFN-β在小鼠模型中的表達情況。水動力注射后24 h做肝臟冰凍切片，熒光顯微鏡觀察后做HE染色區別肝組織和腫瘤組織。結果見圖3A，HE染色顯示在正常肝組織中出現數個腫瘤團塊；熒光顯微鏡觀察顯示水動力注射造成約30%的肝細胞表達了EGFP，而所有腫瘤組織中未見綠色熒光。這說明水動力注射質粒至小鼠移植型肝癌模型能造成外源基因轉導正常肝臟組織，而不能轉導肝癌組織。小鼠模型水動力注射IFN-β表達質粒后24 h外周血中IFN-β 的檢測值為 (3 362±605) pg/mL。

外周血Gluc監測結果 (圖3B) 發現，Hepa 1-6/Gluc細胞接種后，外周血Gluc活性與先前的研究結果一致，1 d后出現輕度的下降，從 2 d起進入指數級的增長，在第5 d給予IFN-β基因治療前 Gluc活性為 (8.17±1.89)×104RLU。EGFP對照組小鼠在質粒注射后，外周血 Gluc活性仍呈指數級增長，直至18～21 d進入平臺期，隨后出現小鼠死亡。與EGFP對照組相比，IFN-β注射組的3只小鼠在治療后4 d出現Gluc活性的明顯抑制，隨后出現迅速下降，分別在21～24 d時降至陰性水平 (＜300 RLU)；IFN-β組的另2只小鼠 Gluc活性也出現一定程度的抑制，但仍持續升高，直至小鼠死亡。觀察小鼠的生存情況(圖3C) 顯示，EGFP對照組小鼠在50 d的觀察期內全部死亡，平均生存期為21.60 d；而IFN-β組存活率為60%，Gluc轉陰的3只小鼠均未出現死亡，2只死亡小鼠的平均生存期為27.50 d，較對照組延長。治療50 d后觀察Gluc轉陰的小鼠肝臟大體情況，發現肝臟腫瘤消失，肝組織HE染色未見腫瘤組織 (圖3D)。IFN-β注射組中腫瘤獲得清除的 3只小鼠治療后 20 d外周血IFN-β 的檢測值為 (2 475±589) pg/mL，而腫瘤持續生長的2只小鼠外周血IFN-β的檢測值明顯降低，分別為413 pg/mL和陰性 (＜250 pg/mL)，這可能是腫瘤生長造成正常肝細胞不能良好表達 IFN-β。上述結果說明，IFN-β基因治療有效抑制了小鼠肝癌模型中腫瘤的生長，甚至可以完全清除肝癌細胞，外周血 Gluc活性靈敏可靠地反映了IFN-β的抗腫瘤治療效果。

圖3 利用Gluc監測腫瘤對干擾素β基因治療的反應Fig.3 Using Gluc to monitor tumor response to the interferon-β gene therapy. (A) Expression of EGFP in the tumor and the liver for the mouse model hydrodynamic injection with EGFP expressing plasmid (arrows indicate tumors).(left) Fluorescence (100×), (right) HE staining (100×). (B) Blood Gluc activities for independent mouse models with hydrodynamic injection of IFN-β or EGFP expressing plasmid (n=5). (C) Survival curve in IFN-β treated mouse models vs EGFP control animals (n=5). (D) Liver mass (left) and HE staining (200×) (right) for IFN-β treated mouse models surviving beyond 50 d.

3 討論

傳統的原位移植型肝癌模型難以實現無侵入性的、實時連續監測體內腫瘤的生長情況，限制了對腫瘤發生、發展的研究和治療效果的評價。利用熒光素酶標記腫瘤細胞并結合動物活體成像定位和監測腫瘤的生長可以一定程度解決這個困難，但需要注射底物和麻醉動物，并且光學信號需要透過組織得到接收，使得精確性較差[2-6]。目前仍需要更靈敏和更方便的方法實現體外監測動物模型體內腫瘤的生長情況。因此，本研究嘗試以分泌型熒光素酶Gluc為報告基因，建立可以體外實時監測腫瘤生長情況的小鼠原位移植型肝癌模型。Gluc具有極高的靈敏度，較螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶靈敏2 000倍，較分泌型堿性磷酸酶靈敏20 000倍[1-3]。Gluc可以分泌入血，通過尾靜脈微量采血測定 Gluc活性可以方便地監測體內生物學過程[2-3]。Gluc在血液中具有很短的半衰期 (大約20 min)，不會隨時間而積累，可以得到體內的實時信息[2-3]。Gluc已經開始用于體外監測體內生物學情況，比如實時監測小鼠腫瘤模型中腫瘤的生長[2-6]、小鼠體內基因表達[7-8]和肝臟miRNA活性[9]。

選擇來源于 C57L小鼠的肝癌細胞系 Hepa 1-6作為肝癌模型的接種細胞。利用 Gluc標記Hepa 1-6細胞后，體外培養時細胞生長良好，培養上清中 Gluc活性可以靈敏可靠地反映細胞數量和細胞的生長情況。將1×106cell的Gluc標記Hepa 1-6細胞通過脾注射至C57BL/6小鼠肝臟成功造成了原位移植型肝癌模型。由于脾臟也出現了腫瘤結節，因此我們在脾注射后將脾臟進行了切除。研究發現，小鼠模型外周血 Gluc活性既能可靠反映體內接種的腫瘤細胞數量也能靈敏反映體內腫瘤的生長情況，Gluc活性與腫瘤的大體情況一致。我們成功利用 Gluc為報告基因建立了可以體外實時監測的小鼠原位移植型肝癌模型。

為證實外周血 Gluc活性能否反映抗腫瘤治療的效果，我們通過水動力注射干擾素β表達質粒對小鼠肝癌模型進行基因治療。干擾素是常用的抗腫瘤細胞因子，具有直接殺傷腫瘤細胞、免疫調節和抑制腫瘤血管生成的作用[10-12]。注射干擾素β可以抑制肝癌細胞的生長并且抑制肝癌的復發[13-14]。由于干擾素具有較高毒性，為實現在體內長期維持較低血藥濃度，人們開始選擇干擾素的基因治療。利用腺相關病毒載體將IFN-β基因導入小鼠肝臟獲得了長期低劑量表達IFN-β，成功預防和清除小鼠神經膠質瘤和黑色素瘤等腫瘤[15-16]。水動力注射法是簡單高效的小鼠轉導基因方法，轉導的基因可以高效在肝臟表達[7-9,17-18]。本研究選擇了水動力方法注射攜帶IFN-β基因質粒DNA至小鼠模型，進行IFN-β基因治療。通過觀察報告基因在肝臟和腫瘤的表達，我們證實水動力注射質粒至移植型肝癌模型可以造成外源基因轉導正常肝臟組織，而不能轉導肝癌組織。水動力注射IFN-β表達質粒后1 d，小鼠外周血即檢測到IFN-β表達，在注射后20 d仍維持在較高水平，從而達到了長期低劑量的IFN-β治療。小鼠模型給予IFN-β基因治療獲得成功，實驗組60%的小鼠腫瘤得以完全清除。外周血Gluc活性監測顯示治療組小鼠Gluc活性均出現抑制，部分小鼠 Gluc出現下降，直至最終檢測不到。肝臟大體和病理研究發現所有 Gluc陰性小鼠的腫瘤均得以完全清除。因此，外周血 Gluc活性可以靈敏可靠地反映IFN-β的抗腫瘤治療效果。

本研究通過脾注射分泌型熒光素酶 Gluc標記的Hepa 1-6細胞在C57BL/6小鼠建立了原位移植型肝癌模型。通過檢測外周血 Gluc水平可以體外實時定量監測體內腫瘤的生長情況并可以靈敏可靠地反映抗腫瘤治療的效果。本方法具有方便、靈敏和實時監測的特點，實現了對單一動物個體的長期研究，有利于對肝癌的發生、發展以及抗腫瘤治療效果的研究。

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Application of secretary luciferase labeled orthotopic transplant model of hepatocellular carcinoma to evaluate tumor response to interferon-β gene therapy

Gang Wang1, Zhonghui Lian2, Wenhong Tian1,2, Xiaoyan Dong3,Jie Yuchi1, and Xiaobing Wu1,4

1Institute for Viral Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing100052,China
2School of Life Science,Jilin University,Changchun130012,Jilin,China
3Beijing Five Plus Molecular Medicine Institute,Beijing100176,China
4Beijing Yizhuang International Biomedical Investment & Management Co. Ltd.,Beijing100111,China

王剛, 連忠輝, 田文洪, 等. 建立分泌型熒光素酶基因標記的原位肝癌模型及用于干擾素β基因治療評價. 生物工程學報, 2012, 28(10): 1236?1244.

Wang G, Lian ZH, Tian WH, et al. Application of secretary luciferase labeled orthotopic transplant model of hepatocellular carcinoma to evaluate tumor response to interferon-β gene therapy. Chin J Biotech, 2012, 28(10): 1236?1244.

Received:March 28, 2012;Accepted:May 19, 2012

Supported by:National Science and Technology Major Project (Nos. 2008ZX10002-023, 2012AA020810).

Corresponding author:Xiaobing Wu. Tel: +86-10-6352-3187; Fax: +86-10-6353-6871; E-mail: wuxb0168@vip.sina.com

國家科技重大專項 (Nos. 2008ZX10002-023，2012AA020810) 資助。