建立蘿藦總皂苷的提取純化及含量測定的方法

田 野 郭 斌 翟鐵紅 李 盈

1.遼寧醫學院，遼寧錦州 121000；2.遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州 121004；3.遼寧省錦州市藥品檢驗所，遼寧錦州 121001

建立蘿藦總皂苷的提取純化及含量測定的方法

田 野1郭 斌2翟鐵紅3李 盈3

1.遼寧醫學院，遼寧錦州 121000；2.遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州 121004；3.遼寧省錦州市藥品檢驗所，遼寧錦州 121001

目的探討提取蘿藦中總皂苷的方法并確定純化樹脂類型并做含量測定，研究其藥用價值。 方法 使用乙醇提取蘿藦中總皂苷，研究各變量對提取效果的影響，采用正交實驗；比較所供四種樹脂的吸附力，指標為總皂苷含量，選取最優；以薯蕷皂苷為標準，采用分光光度法，計算蘿藦總皂苷的含量。 結果 最優提取方案為，乙醇濃度80%，料液比1∶8，溫度70℃，時間1.5 h；D101大孔吸附樹脂效果最好；蘿藦總皂苷含量為15.9%。 結論 乙醇濃度，提取溫度對蘿藦皂苷的提取影響較大，優選出的最佳提取工藝條件及純化總皂苷的方法對蘿藦皂苷進一步開發有很好的參考價值。

蘿藦；總皂苷；提取工藝；純化

蘿藦科植物種類繁多，全球約有180屬，我國境內有44屬，分布區域主要是南方，蘿藦的主要成分是C21甾體苷、生物堿以及強心苷等[1]。在臨床上主治腫瘤、風濕性關節炎等疾病。目前國際上對蘿藦科植物研究頗多，也肯定了大部分植物的藥理作用，如香加皮主治風寒濕痹，其主要成分是C21甾體類、強心苷類以及醛類[2]，由單保恩等[3]研究的杠柳苷則對食管癌有一定的抑制作用；徐佳麗等[4]研究指出，白首烏提取物可使小鼠的腫瘤細胞凋亡；但關于蘿藦有效成分的研究依舊比較空白，不過大量的預實驗表明，蘿藦內存在一定的皂苷類物質，本課題通過優化蘿藦皂苷的提取方法，得到純度較高的總皂苷，為更深入地研究蘿藦的藥用價值做基礎工作。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘿藦；大孔吸附樹脂AB-8、D101、D3520、D2820四種類型；對照品為薯蕷皂苷；乙醇；低速離心機，水浴鍋，干燥箱，電子天平，可見紫外分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取蘿藦總皂苷 以蘿藦總皂苷含量為指標，考察提取條件對收率的影響。結合相關文獻，做L9（34）正交設計，四種提取條件各取3個水平。見表1。

表1 L9（34）正交因素水平設計

1.2.2 純化樹脂的選擇 AB-8、D101、D282 0、D352 0四種樹脂做預處理，各稱取5 g放入錐形瓶中，各加入總皂苷提取液50 mL，于室溫下放置4 h，期間每10 min振搖1次，過濾，測定濾液中蘿藦總皂苷濃度，計算4種樹脂的吸附率以及吸附量；同時計算相應的解析率。依據公式：樹脂的吸附率=（C0-C1）/C0；樹脂的吸附量=V0（C0-C1）/W；樹脂的解析率=C2/（C0-C1）；其中，C0表示：原溶液總皂苷的濃度；C1表示：經過樹脂后皂苷的濃度；C2表示：解析后皂苷的濃度；V0表示：加入原料藥的體積；W表示：濕樹脂的質量。計算這4種樹脂的3項指數并進行評價，選取最優樹脂。

1.2.3 蘿藦總皂苷含量的測定方法

1.2.3.1 制備標準溶液 精密稱取10.0 mg薯蕷皂苷對照品，放入10 mL容量瓶中，稀釋液選擇乙醇，之后定容至刻度，薯蕷皂苷濃度為1 mg/mL。

1.2.3.2 繪制標準曲線 精密量取對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，放入編號不同的加熱容器中，如試管，在70℃下，將乙醇揮發，加入0.2 mL的香草醛-冰乙酸溶液，濃度為10%，再加入0.5 mL的高氯酸；水浴加熱，持續10 min；之后加入冰乙酸稀釋。在410 nm處測定吸光度，以薯蕷皂苷標準品溶液濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得回歸方程為A=0.012 6C-0.168，相關系數 r=0.999 8。

1.2.3.3 樣品溶液的測定 量取提取后的蘿藦總皂苷溶液10 mL，按照上述方法測定吸光度。再代入回歸方程，計算蘿藦總皂苷的含量。按照以下公式進行計算含量：A%=m（樣品總皂苷）×稀釋倍數/m（生藥質量）×100%。

2 結果

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對提取效果的影響 分別取5 g蘿藦藥品3份，將之分別放入回流設備中，容積500 mL，再加入濃度不同的乙醇100 mL，分別是70%、80%和90%，在80℃下回流提取2 h，將提取液進行離心，轉速為每分鐘4 000轉，持續10 min，過濾定容后測定總皂苷的含量，計算得率。實驗數據表明，當乙醇濃度為70%時，得率為2.2%；乙醇濃度為80%時，得率為2.6%；乙醇濃度為90%，得率為1.9%。由此可見，乙醇的濃度越高，蘿藦中總皂苷的得率表現的趨勢是先升高而后降低，但是在乙醇的濃度為80%的時候蘿藦總皂苷的得率最高。

2.1.2 提取時間對提取效果的影響 分別取5 g蘿藦藥品3份，將之分別放入回流設備中，容積500 mL，分別加入濃度為80%的乙醇100 mL，在80℃下回流，3份樣品持續的時間分別為1、1.5、2 h，將提取液進行離心，轉速為每分鐘4 000轉，持續10 min，過濾定容后測定總皂苷的含量，計算得率。

本研究表明提取時間為1.5 h，得率為1.8%；2 h，得率為1.7%；2.5 h，得率為1.5%。可看出與溶劑濃度相反的趨勢，即提取時間越長，蘿藦中總皂苷的得率反而出現下降的趨勢，故蘿藦總皂苷的得率在提取時間為1.5 h的時候是最高的。

2.1.3 料液比對提取效果的影響 分別取5 g蘿藦藥品3份，將之分別放入回流設備中，容積500 mL，分別加入濃度為80%的乙醇，料液比為1∶6、1∶8以及1∶10，在80℃下回流提取1.5 h，分別提取，將提取液進行離心10 min，轉速為每分鐘4 000轉，過濾定容后測定總皂苷的含量并計算得率。

實驗數據表明當料液比為1：6時，總皂苷的得率為1.05%，1∶8時為1.6%；1∶10時為1.57%；由此可看出，原料與溶劑體積比越大，蘿藦中總皂苷的得率表現的趨勢是先升高而后降低，但是在兩者之間的比例為1∶8的時候蘿藦總皂苷的得率最高。

2.1.4 提取溫度對提取效果的影響 分別取5 g蘿藦藥品3份，將之分別放入回流設備中，容積500 mL，分別加入100毫升濃度為80%的乙醇，分別在60℃、70℃以及80℃下回流提取1.5 h，分別將提取液進行離心10 min，轉速為每分鐘4 000轉，過濾定容后測定總皂苷的含量并計算得率。實驗數據表明，60℃時，提取率為1.37%；70℃時為1.41%，80℃時為1.43%。由此可看出，隨著溫度的不斷上升，蘿藦中總皂苷的提取效果也呈現出上升的趨勢，故選定80℃為提取溫度。

2.2 正交實驗結果

在以上單因素實驗的基礎上，對影響蘿藦總皂苷提取得率的四個因素進行L9（34）正交實驗。由表2可知，在此次研究當中設定的影響因素，經試驗結果證明，蘿藦總皂苷最佳提取工藝為：A2B1C2D2，即乙醇濃度為80%，提取溫度為70℃，料液比為1∶8以及提取時間為1.5 h。

表2 醇提正交實驗表及結果

2.3 大孔吸附樹脂的評定結果

4種大孔吸附樹脂中，D3520樹脂的吸附率為65%，比D101樹脂的64%要高，但解析率方面則是D101最高，高達97.72%；在這四種吸附樹脂中，蘿藦總皂苷的吸附量以及解析率在D101樹脂中都比較高，所以選擇D101為此次研究的吸附樹脂。見表3。

表3 不同樹脂的吸附率、吸附量以及解析率的比較

2.4 蘿藦總皂苷的含量測定結果

采用UV法測定，得到蘿藦總皂苷的含量約為15.9%。

2.5 結論

本研究結果顯示，本次研究中蘿藦總皂苷的最佳提取工藝組是8倍于藥材的乙醇，濃度為80%，在70℃的溫度下回流1.5 h。此外，使用D101大孔吸附樹脂對蘿藦總皂苷進行純化是可行的。此次研究對于蘿藦的藥用研究有一定的基礎價值。

3 討論

本實驗以蘿藦全草為提取原料，為了節省溶劑提高效率，蘿藦全草須充分攪碎，其中蘿藦果實中含絮狀易散物質，應在密閉袋中進行粉碎。通過正交試驗選取的最佳提取工藝為：乙醇濃度為80%，提取溫度為70℃，料液比為1∶8以及提取時間為1.5 h。在提取過程中，要密切注意溫度變化，溫度不能超過85℃，以防止總皂苷分解為皂苷元，影響含量測定。

[1]吳振潔，丁林生，趙守訓.鵝絨藤屬植物的化學成分和藥理作用[J].國外醫藥（植物藥分冊），1991，6（4）：147-154.

[2]王利萍，劉建利.香加皮的化學成分和藥理作用研究進展[J].中草藥，2009，40（3）：493-496.

[3]單保恩，趙連梅，何蘭欣，等.杠柳苷對人食管癌細胞增殖的抑制作用及與Rb蛋白表達的關系[J].癌變·畸變·突變，2008，20（5）：342-345.

[4]徐佳麗，厲國強，黃維潔，等.白首烏體外抑制腫瘤細胞成分研究[J].中華中醫藥學刊，2010，28（2）：416-418.

Extraction and purification and content determination of total saponins of japanese metaplexis

TIAN Ye1 GUO Bin2 ZHAI Tiehong3 LI Ying4
1.Liaoning Medical College,Jinzhou 121000,China;2.No.1 Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121004,Cina;3.Jinzhou Drug Inspection Offices,Jinzhou 121001,China

Objective To establish the extraction and purification methods for the； To do the preliminary research for pharmacological effects of the total saponins of Japanese Metaplexis.Methods The L9(34)Orthogonal design were used to determine the optimal extraction method.We Choosed the diosgenin saponins as the reference substance,adopt UV spectrophotometric method,410 nm showed color,calculated the content of the total saponins of Japanese Metaplexis.Choose hydrocortisone as the standard substance,using xylene to rat swelling hair method to measure the anti-inflammatory effect.Results The optimal extraction of the total saponins of Japanese Metaplexis was eight times in crude ethanol (concentration is 80%),70℃ref 1.5 hours,15.9% content.Conclusion The ethanol concentration and temperature has great effects on the total saponins of Japanese Metaplexis extraction.The best extraction and purification methods for the total saponins of Japanese Metaplexis further developmenst has a very good reference value.

Japanese metaplexis;Total saponins;Extraction;Purification

R284

B

2095-0616（2012）05-38-03

2012-02-08）