高粱BTx623幼苗多酚氧化酶Real-time PCR引物擴(kuò)增效率的檢測(cè)

蔡玉笑，張志雯，秦素平，陳于和

(河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北秦皇島，066600)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)在檢測(cè)基因表達(dá)中起到重要的作用，其檢測(cè)結(jié)果靈敏性高，操作簡(jiǎn)便，已被廣大科研人員所廣泛應(yīng)用［1，2］。但在具體操作過程中經(jīng)常出現(xiàn)重復(fù)性不穩(wěn)定的現(xiàn)象，這與引物的擴(kuò)增效率有直接關(guān)系［3～6］。PPO包含2個(gè)銅離子保守結(jié)構(gòu)域，由細(xì)胞核基因編碼然后運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)體中。PPO的活性部位主要在N-結(jié)構(gòu)域，由酪氨酸修飾［7］。近年來，關(guān)于多酚氧化酶的生化特性和反應(yīng)機(jī)理的報(bào)道很多［8］。在菌類中，人們報(bào)道了很多關(guān)于PPO抑制劑，及其在生物工程及生物技術(shù)中可能的臨床應(yīng)用［9，10］。另外，對(duì)于多酚氧化酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)也有了新的研究，其結(jié)構(gòu)酷似軟體動(dòng)物的血藍(lán)蛋白［11］。同時(shí)，人們對(duì)多酚氧化酶活性和生物抗逆性也有了很深的認(rèn)識(shí)，但在高粱幼苗中SbPPO的表達(dá)情況還不是很清楚，本試驗(yàn)對(duì)高粱BTx623幼苗中的SbPPO家族的表達(dá)模式進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1．1 材料

挑選高粱品系BTx623籽粒大且飽滿的種子，在室溫下培養(yǎng)1周，提取總RNA，8種連有200～300 bp外源高粱多酚氧化酶基因的片段和一個(gè)Actin基因片段的pGEM-Teasy質(zhì)粒作為模板，用每一質(zhì)粒的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增。

1．2 引物設(shè)計(jì)

利用軟件Primer Premier 5在8個(gè)高粱籽粒多酚氧化酶基因和1個(gè)Actin基因的非保守區(qū)設(shè)計(jì)特異引物(表1)。

表1 特異引物

1．3 試劑

SYBR-Green購(gòu)自Takara公司，Tripure購(gòu)自羅氏公司，逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司。

1．4 質(zhì)粒濃度稀釋

將9種質(zhì)粒分別先稀釋到10－8ng/L。

分別各取2 μL質(zhì)粒定容到20 μL，將質(zhì)粒稀釋到10－9ng/L。

同樣的方法將9 種質(zhì)粒分別稀釋到 10－10，10－11，10－12ng/L。……