鋅錳拮抗SiO2對中國倉鼠肺成纖維細胞DNA交聯(lián)的實驗研究＊

周 敏，談偉君，龐雅琴，李 陽

（1.廣西右江民族醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，廣西百色533000；2.廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，廣州510060）

鋅、錳是機體必需的微量元素，參與體內(nèi)多種酶的構(gòu)成，在清除自由基方面有重要作用［1－3］。作者前期研究證明鋅、錳在體外有一定的拮抗二氧化硅（SiO2）粉塵致細胞DNA損傷作用［4－5］。本文采用溴化乙錠（EB）熒光法測定DNA交聯(lián)作用，進一步探討葡萄糖酸鋅（ZnG）、氯化錳（MnCl2）單獨及聯(lián)合應(yīng)用拮抗SiO2對中國倉鼠肺成纖維細胞（Chinese hamster fibroblast cell line，CHL）的損傷作用，并尋找二者的最佳劑量組合。

1 材料與方法

1.1 材料 標(biāo)準(zhǔn)SiO2粉塵（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，游離SiO2的含量大于97%，粉塵粒徑小于5μm占95%）；CHL系購自上海細胞研究所；ZnG（廣東制藥廠生產(chǎn)的ZnG片）；MnCl2（上海金山興塔美興化工廠生產(chǎn)的分析純）；RPMI1640培養(yǎng)液；消化緩沖液：10mmol／L三羥甲基氨基甲烷（Tris），25 mmol／L乙 二 胺 四 乙 酸 （EDTA），100mmol／L NaCl，pH＝7.9，10%十二烷基磺酸鈉（SDS），0.1mg／mL蛋白酶 K（臨用前加）；EB緩沖液：20mmol／L K2HPO4，2mmol／L EDTA，1 μg／mL EB。

CO2培養(yǎng)箱 Heal Force Development公司產(chǎn)品，型號：BB5060UV；紫外分光光度計，Cambridge公司產(chǎn)品，型號：78062；熒光分光光度計，日本島津Shimazu公司產(chǎn)品，型號：RF－540。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 取生長良好的CHL，以5×108個／L的密度接種到細胞培養(yǎng)瓶中，經(jīng)24h培養(yǎng)后進行實驗，實驗分為對照組（生理鹽水，不加SiO2）；SiO2（100μg／mL）組；ZnG（2.25 μg／mL）組；MnCl2（1.5μg／mL）組；SiO2＋ZnG組（培養(yǎng)液除含100μg／mL SiO2外，分別含 ZnG 1.00、1.50、2.25μg／mL）；SiO2＋MnCl2組（除含100μg／mL SiO2外，分別含 MnCl20.25、0.50、1.00μg／mL）；ZnG和 MnCl2聯(lián)合作用組（每組除含SiO2100mg／L外，采用析因設(shè)計，ZnG＋MnCl2共設(shè)9個濃度組，染毒2h）。

1.2.2 酚提法提取細胞DNA 加入細胞消化液600μL，56℃水浴過夜，用等體積飽和酚－氯仿異戊醇溶液反復(fù)抽提，取上清液，加入100%冰乙醇沉淀DNA，并用70%乙醇洗2次，室溫晾干，干燥的DNA用適量雙蒸水溶解，待用。

1.2.3 DNA 交聯(lián)的測定［6－8］采用EB熒光法。DNA交聯(lián)率的計算按下述公式：

ct%＝（變性DNA熒光－空白熒光）／（未變性DNA熒光－空白熒光）×100%。式中空白熒光為EB緩沖液的熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進行完全隨機設(shè)計資料的單因素方差分析和析因設(shè)計資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ZnG拮抗SiO2對CHL的DNA交聯(lián)作用 100μg／mL的SiO2可引起CHL DNA交聯(lián)率明顯升高（與對照組比，P＜0.05），2.25μg／mL的ZnG對未染塵的 CHL DNA交聯(lián)作用與對照組比較無明顯變化（P＞0.05）。在染塵CHL中加入不同濃度的ZnG（1.00、1.50、2.25μg／mL）后，DNA交聯(lián)率明顯下降（與SiO2組比較，P＜0.05），隨著ZnG的濃度增加，DNA交聯(lián)率越低，見表1。

表1 ZnG拮抗SiO2對CHL DNA的交聯(lián)作用（±s，n＝6）

表1 ZnG拮抗SiO2對CHL DNA的交聯(lián)作用（±s，n＝6）

＊：P＜0.05，與對照組比較；＃：P＜0.05，與SiO2組比較。

組別DNA交聯(lián)率（%）對照組 4.72±0.85＃SiO2（100μg／mL）組 17.73±0.94＊ZnG（2.25μg／mL）組 4.61±0.89＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.00μg／mL）組 14.77±0.75＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.50μg／mL）組 12.18±0.68＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（2.25μg／mL）組 9.12±0.61＊＃

2.2 MnCl2拮抗SiO2對CHL的DNA交聯(lián)作用 100μg／mL的SiO2可引起CHL DNA交聯(lián)率明顯升高（與對照組比，P＜0.05），1.00μg／mL的 MnCl2對未染塵的CHL DNA交聯(lián)作用與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在染塵CHL中加入不同濃度的 MnCl2（0.25、0.50、1.00μg／mL）后，DNA交聯(lián)率明顯下降（與SiO2組比較，P＜0.05），隨著MnCl2的濃度增加，DNA交聯(lián)率越低，見表2。

表2 MnCl2拮抗SiO2對CHL的DNA交聯(lián)作用±s，n＝6）

表2 MnCl2拮抗SiO2對CHL的DNA交聯(lián)作用±s，n＝6）

＊：P＜0.05，與生理鹽水對照組比較；＃：P＜0.05，與SiO2 組比較。

組別DNA交聯(lián)率（%）對照組 4.72±0.85＃SiO2（100μg／mL）組 17.73±0.94＊MnCl2（1.00μg／mL）組 4.71±0.84＃SiO2（100μg／mL）＋MnCl2（0.25μg／mL）組 15.17±0.72＊＃SiO2（100μg／mL）＋MnCl2（0.5μg／mL）組 11.88±1.02＊＃SiO2（100μg／mL）＋MnCl2（1.0μg／mL）組 9.00±0.83＊＃

表3 ZnG與MnCl2聯(lián)合應(yīng)用拮抗SiO2對CHL的DNA交聯(lián)作用（±s，n＝6）

表3 ZnG與MnCl2聯(lián)合應(yīng)用拮抗SiO2對CHL的DNA交聯(lián)作用（±s，n＝6）

＊：P＜0.05，與對照組比較；＃：P＜0.05，與SiO2 組比較。

組別DNA交聯(lián)率（%）對照組 4.72±0.85＃SiO2（100μg／mL）組 17.73±0.94＊SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.00μg／mL）＋MnCl2（0.25μg／mL）組 13.24±0.82＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.00μg／mL）＋MnCl2（0.5μg／mL）組 13.16±1.42＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.00μg／mL）＋MnCl2（1.0μg／mL）組 13.01±1.48＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.50μg／mL）＋MnCl2（0.25μg／mL）組 12.87±0.47＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.50μg／mL）＋MnCl2（0.5μg／mL）組 8.32±0.85＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.50μg／mL）＋MnCl2（1.0μg／mL）組 12.52±0.28＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（2.25μg／mL）＋MnCl2（0.25μg／mL）組 12.51±1.35＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（2.25μg／mL）＋MnCl2（0.5μg／mL）組 12.15±1.08＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（2.25μg／mL）＋MnCl2（1.0μg／mL）組 11.87±0.95＊＃

表4 ZnG與MnCl2聯(lián)合對DNA交聯(lián)作用影響的方差分析

2.3 ZnG與MnCl2聯(lián)合應(yīng)用拮抗SiO2對CHL的DNA交聯(lián)作用 100μg／mL的SiO2可引起CHL DNA交聯(lián)率明顯升高（與對照組比，P＜0.05），析因設(shè)計方差分析結(jié)果表明，ZnG和MnCl2的交互作用差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3、4。在染塵CHL中加入1.50μg／mL的ZnG與0.50μg／mL的MnCl2時，拮抗SiO2對CHL DNA交聯(lián)的聯(lián)合作用效果最好。

3 討 論

實驗結(jié)果顯示，SiO2可引起CHL DNA交聯(lián)率明顯升高，在染塵CHL中加入不同濃度的ZnG、MnCl2后，DNA交聯(lián)率明顯下降。

鋅、錳對DNA損傷的保護作用機制涉及多方面［9－11］：錳與DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成關(guān)系密切，是其合成過程中多種酶的組成成分和激活劑；可與DNA帶負電荷的磷酸基團產(chǎn)生穩(wěn)定作用而維持DNA的二級結(jié)構(gòu)，防止結(jié)構(gòu)的突變；還可構(gòu)成Mn－SOD，可抵抗自由基對DNA的攻擊。鋅是核酸的豐富組分，能穩(wěn)定RNA、DNA、和核糖體的結(jié)構(gòu)，鋅可通過鍵合于DNA骨架鏈上的磷酸基團和核苷的堿基而穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)。

本實驗采用析因設(shè)計研究ZnG與MnCl2聯(lián)合應(yīng)用拮抗SiO2對CHL的DNA交聯(lián)作用，方差分析結(jié)果表明，ZnG與MnCl2的交互作用差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，在染塵CHL中加入1.50μg／mL的ZnG與0.50μg／mL的 MnCl2聯(lián)合作用時，拮抗SiO2對CHL DNA交聯(lián)的效果最好。二者聯(lián)合拮抗SiO2致細胞DNA損傷的作用機制可能是它們共同抗氧化的結(jié)果。

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