羧甲司坦對慢性氣道炎癥大鼠肺組織中PI3K／AKT和γ－GCS表達的影響

李國吾，夏熙鄭，劉待見

（鄭州大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，鄭州450014）

氧化－抗氧化失衡是慢性氣道炎癥的主要發(fā)病機制之一［1］。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是體內(nèi)重要的抗氧化劑，在保護氣道上皮細胞完整性、抵御肺部損傷與抗炎等方面發(fā)揮重要的作用［2］。γ－谷氨酰半胱 氨酸合 酶（γ－glutamylcysteine synthetase，γ－GCS）是GSH合成的限速酶，對GSH生成的速度和量具有調(diào)控作用［3］。最新發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇－3－激酶（phosphatidylinositol－3－kinase，PI3K）／蛋白激酶 B（protein kinaseB，AKT）通路可能調(diào)控γ－GCS的表達［4］。羧甲司坦是經(jīng)典的黏痰溶解劑，最新的體外研究證實其具有抗氧化作用，但其具體的作用機制尚不清楚［5］。本實驗旨在探討羧甲司坦對PI3K／AKT通路及γ－GCS表達的影響，研究其抗氧化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 羧甲司坦片為廣州白云山制藥股份有限公司產(chǎn)品，脂多糖試劑購自美國Sigma公司，還原型GSH測試盒購自南京建成生物工程研究所，兔抗磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p－AKT）、γ－GCS多克隆抗體為美國Santa cruz公司產(chǎn)品，通用型SP系列工作液試劑盒（SP－9000）購自北京中杉生物工程公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptasepolymerase chain reaction，RT－PCR）測試盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗動物分組及模型制備 清潔級雄性Sprague－Dawley（SD）大鼠30只（鄭州大學實驗動物中心），平均體質(zhì)量（190.0±10.0）g，按隨機數(shù)字表法分為3組，每組10只。本實驗采用國內(nèi)通用方法［6］：（1）模型組：第1、16天，大鼠用10%水合氯醛3mL／kg腹腔注射麻醉后，將脂多糖（1mg／mL）200μL注入氣管內(nèi)；在第2～15天、第17～30天將大鼠置入自制密閉箱內(nèi)被動吸紅旗渠牌香煙（每支含尼古丁1mg，焦油10mg），煙霧濃度約5%（v／v），每天2次，每次約1h；第17～30天上午吸煙前30min予生理鹽水1.5mL灌胃。（2）羧甲司坦治療組：脂多糖處理及煙熏同模型組；第17～30天上午吸煙前30min給予羧甲司坦500mg／kg灌胃。（3）對照組：正常飼養(yǎng)，第1、16天用10%水合氯醛3mL／kg腹腔注射麻醉，氣管內(nèi)注入生理鹽水200μL，第17～30天給予生理鹽水1.5mL灌胃。所有大鼠均在第31天用10%水合氯醛3mL／kg腹腔注射麻醉，頸動脈放血處死，行肺泡灌洗，留取實驗標本。

1.3 實驗方法

1.3.1 支氣 管 肺 泡 灌 洗 液 （bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的涂片計數(shù) 頸動脈放血處死大鼠，開胸分離出氣管及肺組織，結(jié)扎右主支氣管，在氣管中上1／3環(huán)狀軟骨處離斷，將靜脈套管順氣管方向插至左側(cè)肺門處并固定，用生理鹽水3mL注入左肺，停頓30s后回抽，反復3次，BALF回收率約80%，將BALF行涂片細胞分類計數(shù)。

1.3.2 肺組織病理學觀察及組織標本的保存 取左側(cè)肺組織，用4%甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木素－伊紅染色后光學顯微鏡觀察。切取右下肺，將其浸入4%多聚甲醛固定后用于免疫組織化學檢測；其余右肺迅速置于液氮，－80℃保存，用于 GSH、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、總抗氧化能力（total antioxidative capability，T－AOC）和 RT－PCR檢測。

1.3.3 肺組織p－AKT及γ－GCS的免疫組織化學檢測 采用免疫組織化學鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶（streptavidinperosidase，SP）法檢測p－AKT蛋白及γ－GCS蛋白的表達。取4%多聚甲醛固定的右下肺組織，石蠟包埋切片，脫蠟至水，抗原修復，加山羊血清封閉，先后加入第一、二抗體，二氨基聯(lián)苯胺（3，3′－diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染后脫水封片。細胞核出現(xiàn)棕黃或棕褐色為陽性。使用Biosens Digital Imaging System（V1.6）圖像分析系統(tǒng)檢測圖像中陽性區(qū)平均積分光密度。

1.3.4 肺組織PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA的 RT－PCR檢測 將待檢肺組織取出后在液氮下研磨，加入1mL Trizol試劑抽提RNA，RNA純度、含量及完整性的檢測和RT－PCR操作步驟均依照文獻進行。PI3 KmRNA上游引物：5′－AGA TGA GGT GAG GAA CGA AGA A－3′，下游引 物：5′－AGG AGG AAG CGG TGG TCT A－3′，擴增片段為480bp；γ－GCS mRNA上游引物：5′－AGA TGA TAG AAC ACG GGA GG－3′，下游引物：5′－CAC AAA TAC CAC ATA GGC AGA－3′，擴增片段為424bp；β－actin上游引物為：5′－ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A－3′，下游引物為：5′－CAT CTC TTG CTC GAA GTC TA－3′，擴增產(chǎn)物為318bp。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，置于暗箱式紫外透射儀中成像，軟件分析計算灰度值。

1.3.5 肺組織GSH、ROS及T－AOC含量的檢測 取右肺組織用比色法按試劑盒操作說明書測定GSH、ROS及T－AOC的含量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BALF中炎癥細胞的表達 模型組大鼠BALF中細胞總數(shù)較對照組明顯增多（P＜0.05），其中以中性粒細胞增多為主。羧甲司坦治療組細胞總數(shù)較模型組明顯降低（P＜0.05），但較對照組明顯增多（P＜0.05）。見表1。

2.2 肺組織病理學改變 對照組大鼠氣道上皮細胞完整，肺組織結(jié)構(gòu)正常；模型組上皮細胞脫落、壞死嚴重，可見大量炎癥細胞浸潤；羧甲司坦治療組上皮細胞脫落、壞死及炎癥細胞浸潤較模型組減輕。

2.3 肺組織中p－AKT蛋白及γ－GCS蛋白的表達 模型組大鼠肺組織中p－AKT蛋白及γ－GCS蛋白的表達明顯高于羧甲司坦治療組和對照組（P＜0.05），羧甲司坦治療組大鼠肺組織中p－AKT蛋白及γ－GCS蛋白的表達明顯高于對照組（P＜0.05）。見表2。

2.4 PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA表達 RT－PCR顯示，模型組PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA表達明顯高于羧甲司坦治療組和對照組（P＜0.05），且羧甲司坦治療組PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA表達明顯高于對照組（P＜0.05）。見圖1、表2。

2.5 肺組織中GSH、ROS及T－AOC的含量 與對照組比較，模型組及羧甲司坦治療組大鼠肺組織GSH及ROS含量均增加，ROS的增加尤為明顯，而T－AOC含量顯著降低（P＜0.05）。提示模型組和羧甲司坦治療組的GSH的增加不足以抵抗ROS的增加，存在氧化－抗氧化失衡。見表3。

表1 各組大鼠BALF細胞總數(shù)及分類 （±s）

表1 各組大鼠BALF細胞總數(shù)及分類 （±s）

＊：P＜0.05，與對照組比較；＃：P＜0.05，與模型組比較。

組別 細胞總數(shù)（×105／mL） 細胞分類（%）單核－巨噬細胞 中性粒細胞 淋巴細胞對照組1.65±0.38 81.13±2.58 13.21±1.76 5.66±0.91模型組 7.32±0.77＊ 65.15±4.85＊ 30.43±4.54＊ 4.42±1.19＊羧甲司坦治療組 4.20±0.61＊＃ 78.15±5.41＊＃ 16.14±3.94＊＃ 5.71±2.37＊＃

表2 各組大鼠肺組織p－AKT蛋白、γ－GCS蛋白、PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA的表達

2.6 p－AKT與γ－GCS蛋白及γ－GCS mRNA的相關(guān)性 慢性氣道炎癥大鼠肺組織中p－AKT與γ－GCS蛋白及γ－GCS mRNA的表達均呈顯著性正相關(guān)（r＝0.812，r＝0.741；P＜0.01）。

表3 各組大鼠肺組織GSH、ROS及T－AOC的含量

圖1 大鼠肺組織PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA的表達

3 討 論

炎癥和氧化－抗氧化失衡是慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）的重要的發(fā)病機制［7］。本實驗顯示，模型組BALF中細胞總數(shù)、中性粒細胞數(shù)明顯增加，肺組織炎癥細胞浸潤明顯，支氣管黏膜排列紊亂；與對照組比較，模型組大鼠肺組織中GSH、ROS含量均增高，前者增高的程度低于后者；而T－AOC顯著降低，表明模型組肺組織中存在炎癥和氧化－抗氧化失衡。

本實驗顯示，模型組大鼠肺組織中p－AKT蛋白、γ－GCS蛋白、PI3 KmRNA及γ－GCS mRNA的表達水平均較對照組明顯提高，提示慢性氣道炎癥大鼠肺組織中存在氧化應激反應，相關(guān)性分析顯示p－AKT與γ－GCS蛋白及γ－GCS mRNA的表達呈正相關(guān)，說明PI3K／AKT的信號通路途徑可能參與調(diào)節(jié)γ－GCS的表達。γ－GCS是GSH 合成的限速酶，γ－GCS的高表達促進GSH合成增加，從而參與局部抗氧化作用。Li等［8］在研究中發(fā)現(xiàn)PI3K的抑制劑LY294002能阻止GSH的上調(diào)。Arisawa等［9］研究證明P13K／AKT通路經(jīng)過熊去氧膽酸活化后可促進紅系衍生的核因子2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2－related factor 2，Nrf2）核轉(zhuǎn)位，從而調(diào)控γ－GCS的表達。Martin等［10］也發(fā)現(xiàn)，PI3K可能激活一些有助于增加Nrf2蛋白水平的穩(wěn)定蛋白的轉(zhuǎn)錄。實驗結(jié)果提示PI3K／AKT信號通路通過增加Nrf2上游調(diào)控激酶的表達促進Nrf2核轉(zhuǎn)位，從而提高γ－GCS的表達水平，進而增加GSH的合成。

羧甲司坦是經(jīng)典的黏痰溶解藥物，它可以裂解二硫鍵，改善痰的黏滯性［11］。最新研究表明，因其分子結(jié)構(gòu)中含有較高的巰基（－SH），可能具有抗感染、抗氧化應激作用［12－13］。本實驗通過早期應用羧甲司坦干預被動吸煙大鼠慢性氣道炎癥來觀察其作用。羧甲司坦治療組大鼠BALF中細胞總數(shù)較模型組有所降低，中性粒細胞數(shù)也顯著減少。肺組織病理學檢測顯示，羧甲司坦治療組支氣管黏膜上皮結(jié)構(gòu)排列混亂、中性粒細胞浸潤均較模型組有所減輕，說明羧甲司坦治療組氣道炎癥有所減輕。羧甲司坦治療組的PI3 KmRNA、p－AKT蛋白及γ－GCS蛋白的表達水平均較模型組降低，GSH、ROS含量也較模型組有所降低，且ROS降低較為明顯，T－AOC也顯著升高，說明羧甲司坦治療組氧化－抗氧化失衡有所改善。綜上所述，提示羧甲司坦具有抗感染、抗氧化作用。Yasuda等［14］臨床研究也表明羧甲司坦在抗氧化、減輕系統(tǒng)性炎癥等方面發(fā)揮重要作用。國內(nèi)22個多中心的PEACE臨床研究表明羧甲司坦可使COPD急性發(fā)作率降低24.5%，其確切機制尚不清楚［12］。最新的體外研究證實羧甲司坦可通過清除ROS發(fā)揮抗氧化作用［15］。這與本實驗結(jié)果一致，即羧甲司坦可減輕被動吸煙大鼠肺部的炎癥和氧化應激。

總之，本研究表明PI3K／AKT信號通路可參與對抗氧化基因γ－GCS的調(diào)控，其可能機制為被動吸煙消耗抗氧化物GSH，造成氧化－抗氧化失衡，同時又激活PI3K／AKT信號通路，增加Nrf2上游的調(diào)控蛋白的表達，引起Nrf2核轉(zhuǎn)位，后者與γ－GCS基因啟動子上相應位點結(jié)合，啟動γ－GCS mRNA的轉(zhuǎn)錄，提高γ－GCS的含量，從而增加GSH的合成，對抗氧化應激，改善氧化－抗氧化失衡。本實驗進一步證明了羧甲司坦具有減輕炎癥細胞浸潤，清除ROS，發(fā)揮抗感染、抗氧化的作用，為羧甲司坦的臨床應用提供了依據(jù)。

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