口腔鱗癌腫瘤標記物血清蛋白組學的初步研究＊

馬 洪，趙天江，王金生，曹星華，潘 衛

（貴陽醫學院，1.口腔醫學系口腔頜面外科學教研室；2.醫學檢驗系蛋白組學實驗室 550004）

腫瘤嚴重威脅人類的健康，大量研究證實，早期診斷和早期治療是防治腫瘤，降低病死率的有效措施。因此，為提高腫瘤的早期診斷而對腫瘤標記物的研究成為人們關注的焦點［1］。蛋白質組學（proteomics）是從整體角度分析細胞內動態變化的蛋白質組成成分、表達水平與修飾狀態，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，從而揭示生物學行為以及基因表達調控機制的一個新的研究領域，為腫瘤研究提供了強有力的技術平臺。應用蛋白質組學技術，分析腫瘤細胞與正常細胞內不同蛋白質在其表達、表達數量、表達位置和修飾狀態上的差異，是發現新的腫瘤標記物的有效途徑［2］。本研究采用雙向凝膠電泳技術分離口腔鱗癌患者和健康人外周血清總蛋白，比較口腔鱗癌患者和健康人差異表達明顯的蛋白點，再應用質譜技術以及生物信息學分析，鑒定出這些差異表達的蛋白質種類和性質，以期發現具有早期診斷和治療評估價值的腫瘤標記物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 主要試劑：考馬斯亮藍R－250與G－250購自Sigma公司，碘乙酰胺購自ACROS公司，小牛血清為GibeoBRL公司的產品，固相pH梯度（immobilized pH gradients，IPG）緩沖液、IPG膠條（13cm，線性，pH 3～10）、甘氨酸、2DQuant蛋白質定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、蛋白質分子量標準、2D－clean up試劑盒等購自 AmershamPharmacia Biotech公司；主要儀器：UV－2401PC紫外可見分光光度計（日本島津儀器有限公司）、超低溫冷凍離心機（sigma公司）、Image Scanner掃描儀（Amersham Bio sciences公司）、Ettan IPGphorⅡ等電聚焦儀（Amersham Biosciences公司）、Electrophoresis Power Supply－EPS 601垂直電泳儀（Amersham 公司）、Image Master 2Dplatirum 6.0圖像分析軟件（Amersham公司）。

1.2 標本 17例鱗癌血清標本（鱗癌組）來自2007年1月至2009年2月于貴陽醫學院附屬醫院口腔頜面外科就診的口腔鱗癌患者，其中，男13例，女4例；年齡50～68歲，平均59.3歲；病理分級：高分化鱗癌11例，中分化鱗癌6例；均經病理證實且未接受任何針對腫瘤的治療如手術、放射治療及化療等。17例對照血清（對照組）來自貴陽醫學院2008、2009級身體健康的口腔頜面外科研究生，既往無腫瘤史。

1.3 標本采集及蛋白質樣本制備 所有標本均為清晨空腹靜脈血，靜置待血清析出后離心5min（離心半徑8cm，4 000r／min），－80℃保存待用。實驗前將－80℃保存的血清融解，根據清蛋白和IgG去除試劑盒說明書的操作步驟去除高豐度蛋白。將100μL樣品加入3倍體積的沉淀劑及100μL的裂解液中室溫孵育，室溫下（20℃）離心2～5min（離心半徑8cm，12 000r／min），收集上清液儲存樣品至1mL環氧樹脂管中。

表1 7個差異蛋白點質譜分析和數據庫查詢結果

1.4 Bradford法檢測蛋白濃度 在核酸蛋白分析儀中，以考馬斯亮蘭G－250調零，于595nm波長處檢測樣本的吸光度值，繪制標準曲線。標準曲線在0.25～16mg／mL范圍內呈線性，將蛋白樣本用超純水10倍稀釋后測定，測定方法與標準曲線相同，同一樣本平行檢測3次后取其平均吸光度值，通過標準曲線計算樣本的蛋白質濃度。

1.5 雙向凝膠電泳分離蛋白 13cm，線性，pH3～10IPG膠條等電聚焦；膠條平衡；SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE）；染色、脫色。

1.6 凝膠圖像分析 染色、干燥后的電泳凝膠用Image scanner掃描儀進行掃描，獲取血清蛋白質電泳圖像，然后用Image Master 2DPlatinum 6.0軟件進行圖像分析，篩選差異蛋白斑點。

1.7 液相色譜－串聯質譜（liquid chromatography－tandem mass spectrometry，LC－MS／MS）分析及數據檢索［3］樣品蛋白被酶切成若干肽段，經高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分離后，逐一流入質譜中進行肽段檢測，肽段檢測后（一級質譜），該肽段又通過與氦氣分子的碰撞誘導解離（collision－induced dissociation，CID），斷裂成許多肽段碎片，這些碎片的質量也被質譜檢測記錄下來（二級質譜）；檢測后的肽段質量與碎片質量，通過專用軟件與特定蛋白數據庫中蛋白序列的理論酶切肽段及其碎片進行比對，對蛋白質進行鑒定。

2 結 果

鱗癌組和對照組血清進行雙向凝膠電泳，發現有7個蛋白點差異表達明顯，結果見圖1。將這7個差異蛋白點進行LC－MS／MS鑒定以及數據庫檢索，見表1，綜合得分均超過30.0分。3號樣品經過氨基酸覆蓋率及二級質譜鑒定為觸珠蛋白［haptoglobin（Homo sapiens）］，綜合得分為602.2分，4號樣品為觸珠蛋白同型前原蛋白（haptoglobin isoform 1preproprotein），綜合得分為140.3分。

圖1 血清雙向凝膠電泳圖譜（考馬斯亮藍R250染色）

3 討 論

口腔腫瘤的蛋白質組學研究一方面能建立口腔腫瘤的全蛋白表達譜，用于腫瘤的分離鑒定；另一方面通過分析腫瘤組織蛋白與正常組織蛋白的差異表達，篩選出各種病損的特異蛋白，構建腫瘤發生、發展的蛋白質組譜和分子機制，發現并評估組織、血清及唾液中的特異蛋白作為生物標記，有利于臨床的無創傷早期診斷及分級［4－5］。國內有學者對口腔鱗癌組織和口腔正常黏膜組織中差異表達的蛋白質進行研究，發現β纖維蛋白、磷酸丙糖異構酶等在口腔鱗癌的發生、發展過程中發生了改變［6］。有人對具有不同侵襲力的口腔鱗癌細胞系培養液中的差異蛋白質進行檢測，發現在高侵襲口腔鱗癌細胞系中，23個蛋白質表達上調，1個表達下調，并認為蛋白質組學技術在篩選不同侵襲力細胞系之間的差異蛋白質方面也有應用價值［7］。

本實驗采用雙向凝膠電泳，結合LC－MS／MS鑒定技術，比較口腔鱗癌患者和正常人血清中差異蛋白的表達情況，結果發現觸珠蛋白在口腔鱗癌血清中高表達。觸珠蛋白又叫結合珠蛋白，是血清α2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白，相對分子質量為85 000，廣泛存在于人類和許多哺乳動物的血清和其他體液中，主要在肝臟中合成。觸珠蛋白是一種急性期蛋白（acute phase protein，APP），腫瘤患者，特別是伴癌細胞壞死時，觸珠蛋白的表達水平明顯升高。其主要生理功能是通過與游離血紅蛋白結合形成觸珠蛋白－血紅蛋白復合物，將血紅蛋白轉運至肝臟中代謝，從而避免血紅蛋白和鐵從腎臟丟失及其對腎臟的損傷。此外還參與宿主抗感染、損傷組織的修復以及內環境的穩定。除以上的功能外，還有抗氧化、抑制前列腺素合成、抑制細菌、促進血管生成及重要的免疫作用［8］。血清觸珠蛋白含量在感染、創傷、炎癥、腫瘤及心肌梗死等病理狀態時顯著升高。研究指出，不同基因型觸珠蛋白由于結構不同，功能上存在差異，觸珠蛋白HP2－2基因型糖尿病患者的心血管并發癥的發生率顯著高于其他基因型，這可能與其體內較高的氧化應激狀態有關［9］。也有研究發現，乙型肝炎患者血清觸珠蛋白和補體因子B（complement factor B，CFB）水平隨著肝功能損害的加重而逐漸下降，觸珠蛋白和CFB血清水平在一定程度上可以反映肝細胞受損的嚴重程度［10］。

應用蛋白組學技術對卵巢癌患者與正常人血清中差異蛋白的一項研究提示觸珠蛋白在病理血清中表達上調［11］；后續研究發現，卵巢癌患者血清中觸珠蛋白、糖鏈抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）水平異常升高，觸珠蛋白升高尤為明顯，因此，有學者認為它可作為卵巢癌的輔助診斷指標［12］；同樣在對卵巢癌患者癌組織、癌旁組織及正常卵巢黏膜組織雙向凝膠電泳的蛋白質表達圖譜研究中也發現癌組織中有8種蛋白質差異表達，其中有4種為結合珠蛋白的亞型［13］；對阿爾茨海默病患者與正常人血清差異蛋白的研究也表明觸珠蛋白在所有病理血清中均為高表達［14］；對肺鱗癌患者和健康人的血清蛋白質的一項研究提示觸珠蛋白－2是肺鱗癌的血清候選分子標記物，提出血清中觸珠蛋白－2水平對肺鱗癌診斷可能具有一定的參考價值［15］；同樣一項對胰腺癌患者與健康人血清的蛋白質組學研究顯示在胰腺癌組中共有78個蛋白點有顯著性改變，其中，成功鑒定55個蛋白點，29個蛋白點在胰腺癌組高表達，其中含觸珠蛋白［16］。不過國內有學者在腎母細胞瘤患兒血清蛋白質標記物的篩選及鑒定的研究中發現觸珠蛋白在腎母細胞瘤患兒血清中低表達，在術后及正常小兒血清中高表達，提示腎母細胞瘤對肝臟合成觸珠蛋白可能有抑制作用［17］。

本實驗對口腔鱗癌患者血清蛋白中表達明顯的7個蛋白點進行質譜鑒定，根據數據庫的搜索結果，成功鑒定了其中2個蛋白質點，分別為觸珠蛋白及其同型前原蛋白，它們在口腔鱗癌患者血清中均呈高表達，這表明觸珠蛋白可能成為口腔鱗癌的血清腫瘤標記物之一，但其機制及特異性研究還遠遠不夠，口腔鱗癌蛋白質組學研究任重道遠。

（本研究中LC－MS／MS質譜分析及檢索由中國科學院動物研究所生物膜與膜生物工程國家重點實驗室完成。特別志謝！）

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