ELISA方法檢測慢性心房顫動患者心房肌中SK2蛋白的表達＊

李 濤，毛 亮，譚曉秋，李妙齡，楊 艷，劉智飛，曾曉榮

（瀘州醫學院心血管醫學研究所，四川瀘州646000）

小 電 導 鈣 激 活 鉀 通 道 （small conductance Ca2＋－activated K＋channels，SK）在不同的組織廣泛表達，包括腦、神經系統、骨骼肌以及平滑肌等［1－2］。SK蛋白參與調節神經的興奮，激素的分泌以及神經元動作電位緩慢后超極化等功能。到目前為止，SK 有3個基因編碼：SK1、SK2、SK3（KCNN1、KCNN2和KCNN3），其中SK2蛋白對apamin最敏感，其半阻斷濃度為60pmol／L［3］。

近幾年來，心房組織SK2蛋白的研究成為熱點，在人和小鼠的心房組織中，SK2蛋白在肌細胞復極化的過程中，特別是動作電位的末期起到非常重要的作用，并且SK2蛋白在心房和心室組織的表達量不同，在心房組織的表達明顯高于心室［4］。本試驗主要研究慢性心房顫動患者心房組織SK2蛋白的變化情況。應用酶聯免疫吸附測定（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）技術檢測人心肌細胞SK2蛋白在竇性心律和心房顫動心律表達的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料 22例接受體外循環手術的患者均為瀘州醫學院附屬醫院心胸外科的住院患者，取其常規切除的右心耳組織標本作為研究對象。本實驗得到瀘州醫學院倫理委員會的批準，所有試驗程序遵照國內的相關法規和政策。根據心房顫動的定義標準將標本分為2組：竇性心律組12例、心房顫動心律組10例，患者臨床資料見表1，其性別、年齡、心率、心功能和超聲心動圖指標的差異均無統計學意義。

表1 竇性心律和心房顫動患者的臨床資料

1.2 膜蛋白的提取 組織剪碎加入1mL蛋白提取液，液氮研磨，冰上孵育30min，4℃，10 000g離心5min，取上清液。

1.3 蛋白濃度的檢測 采用美國Thermo公司的二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒，將試劑A與試劑B按照50∶1的體積比混合成工作液，每個微孔中加入200μL工作液，依次再加入10μL的標準品或待檢測的蛋白樣品，輕微震蕩混勻，避免產生氣泡，37℃孵育30min，冷卻到室溫后，用Tecan Infinite M200型多功能酶標儀在562nm處檢測光密度值。

1.4 ELISA試驗 采用美國Uscn公司人KCNN2ELISA試劑盒（Uscn E80050HU）依次將標準品、待測樣品100μL加入到酶標板中，蓋上覆膜，防止樣品蒸發，37℃溫育2h，棄去液體，每孔加檢測A工作液100μL，酶標板加上覆膜，37℃溫育1h，棄去孔內液體，每孔用350μL洗滌液洗滌，浸泡1～2min，棄去液體后，重復洗板3次，甩干孔內的洗滌液，然后每孔加入檢測B工作液100μL，酶標板加上覆膜，37℃溫育30min；棄去孔內液體，洗板5次。每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色10～15min。最后每孔加終止溶液50μL終止反應，此時溶液由藍色立即轉為黃色。終止液的加入順序和底物溶液的加入順序相同，在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在450nm波長測定各孔的光密度值。

1.5 統計學處理 采用SPSS10.0軟件進行統計學分析，計量數據用±s表示，組間比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

ELISA方法可以檢測到人心房肌細胞SK2蛋白的表達，人KCNN2ELISA的標準曲線見圖1。每孔上樣量總蛋白為0.1mg的條件下，竇性心律組患者心房肌細胞SK2蛋白濃度為（1.13±0.12）ng／mL，心房顫動心律組患者心房肌細胞SK2蛋白濃度為（3.98±0.48）ng／mL，兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 人KCNN2ELISA的標準曲線

3 討 論

心房顫動是臨床上最常見的持續性心律失常，是由不規則的、紊亂的心房電活動所引起，常見于風濕性心臟病和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病。慢性心房顫動不但發病率高，持續時間長，且伴有嚴重的并發癥，嚴重威脅人類的健康。

目前對心房顫動發生機制的研究主要有3種學說：折返機制學說、主導環學說及“心房顫動致心房顫動”學說。其中“心房顫動致心房顫動”指的是心房顫動的反復發作或者連續的電刺激會導致心房電重構（atrial electrical remodeling，AER）的改變，其后果使心房顫動趨于一種自我維持狀態。AER表現為心肌有效不應期（effective refractory period，ERP）進行性縮短，離散度增加，頻率適應性下降、消失或反向變化，這些改變對心房顫動的發生、維持和發展起著重要的作用。不管是慢性心房顫動患者，還是心房顫動的動物模型，心房細胞L型鈣電流（L type calcium current，ICa－L）、瞬間外 向 鉀 電流（transient outward potassium current，Ito）明顯下調，同時內向整流鉀電流（inward rectifier potassium current，Iki）上調，但乙酰膽堿敏感性鉀電流（acetylcholine sensitive potassium current，IkACh）在心房顫動時的變化報道不一致［5－8］，這也說明心房多通道電流參與了心肌細胞的AER過程［9］。

有人應用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptase－polymerase chain reaction，RT－PCR）、Western blot以及共聚焦熒光成像等實驗方法證實了在小鼠和人的心房和心室肌細胞存在SK2蛋白。電生理實驗研究發現，SK2電流為外向電流，可以使心房肌細胞動作電位末期復極化時程縮短，相反，加入特異性的阻斷劑apamin后，SK2受到抑制，動作電位時程延長。這表明SK2電流可能參與心肌動作電位復極的過程。因此，SK2蛋白的電生理學意義可能與維持心肌細胞正常的動作電位時程和形態有關。并且SK2電流密度在小鼠的心房肌細胞和心室肌細胞存在差異，即心房肌細胞SK2電流密度遠遠大于心室肌細胞。

目前關于心房顫動與SK2蛋白研究的報道不多，并且還局限于動物模型。Ozgen等［10］研究發現，兔肺靜脈經過間歇、短陣的高速起搏后，肺靜脈肌嗅細胞SK2mRNA、蛋白以及電流水平都相應增加，動作電位復極時程縮短，而動作電位時程縮短又是引起心房顫動的原因之一。通過免疫熒光染色后觀察到SK2蛋白從核周向細胞膜轉移，這也說明SK2蛋白參與細胞電重構。這是第一次將SK2蛋白與心房顫動的關系進行研究，也為致心律失常因素的研究提供了基礎。丹麥的Diness等［11］用自發研制的SK阻滯劑NS8593，觀察其對大鼠心房顫動模型的影響，NS8593作用機制是通過降低SK蛋白對鈣離子敏感性，影響SK蛋白的活性。這種阻滯劑可以預防和終止離體和在體的大鼠心房顫動模型，并且NS8593還是心房特異性藥物，不影響心室的電活動。研究發現持續性心房顫動患者的右心耳SK2電流明顯增加，這表明心肌細胞SK2蛋白參與和介導了心房顫動的AER過程［12］。但是在完全敲除SK2基因的小鼠模型上發現，心房肌細胞的動作電位時程明顯延長，特別是動作電位的末期延長，而動作電位的末期對異常興奮極其敏感，容易誘發早后除極，從而導致心房顫動的發生，這與經典的心肌動作電位時程縮短導致心房顫動的觀點相違背［13］。SK2的電重構除了參與心房顫動的發生機制，還在心力衰竭的家兔誘發的心室顫動模型上發現，心室外膜肌細胞SK2蛋白及電流水平增加，導致細胞動作電位時程明顯縮短，容易誘發心室顫動［14］。

ELISA是一種敏感性高、特異性強、重復性好的實驗方法，其試劑穩定、易保存、操作簡便、結果較客觀，既適宜于大規模篩查試驗又可以用于少量標本的檢測，既可以做定性試驗也可以做定量分析等優點，目前已廣泛應用于臨床診斷和基礎研究領域。雖然ELISA方法靈敏度及特異性相對較高，但只能檢測到目的蛋白的ng水平，因此，如果提取標本的蛋白濃度較高，建議將其稀釋后再進行ELISA實驗。Western blot和ELISA都是可以進行蛋白檢測的實驗方法，與ELISA方法相比，Western blot只能進行半定量檢測，但是可以加入內參與目的蛋白進行比較，這點ELISA做不到。可以根據實驗的需要，選擇適宜的蛋白檢測方法。由于本實驗標本含有血液，紅細胞破壞溶解時會釋放有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）為標記的ELISA檢測過程中，會導致非特異性顯色，干擾實驗的檢測結果［15］。因此在進行標本研磨前，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗組織，以減少血凝塊和紅細胞對實驗結果的影響。

綜上所述，在慢性心房顫動時人心房肌右心耳組織SK2蛋白表達量明顯增加。基于SK2電流在心房組織和心室組織的表達不同，SK蛋白的特異性阻滯劑提供了治療心房顫動的可能，這種藥物直接針對心房肌細胞而不影響心室肌細胞的電活動，這可以減少傳統抗心律失常藥物的不良反應，也為臨床新藥的研發提供實驗基礎和理論依據。

［1］ Stocker M，Pedarzani P.Differential distribution of three Ca（2＋）－activated K（＋）channel subunits，SK1，SK2，and SK3，in the adult rat central nervous system［J］.Mol Cell Neurosci，2000，15（5）：476－493.

［2］ Favero M，Jiang DJ，Chiamulera C，et al.Expression of small－conductance calcium－activated Potassium channels（SK3）in skeletal muscle：regulation by muscle activity［J］.J Physiol，2008，586（Pt 19）：4763－4774.

［3］ Xia XM，Fakler B，Rivard A，et al.Mechanism of Calcium gating in small－conductance calcium－activated Potassium channels［J］.Nature，1998，395（6701）：503－507.

［4］ Xu Y，Tuteja D，Zhang Z，et al.Molecular identification and functional roles of a Ca（2＋）－activated K＋Channel in human and mouse hearts［J］.J Biol Chem，2003，278（49）：49085－49094.

［5］ 丁銀元，曾曉榮，楊艷，等.血管緊張素Ⅱ對心房顫動患者外向鉀電流的作用［J］.中國病理生理雜志，2007，23（7）：1422－1425.

［6］ 李妙齡，曾曉榮，楊艷，等.持續性心房顫動患者心房肌細胞L型鈣通道電流變化的研究［J］.中華心血管病雜志，2006，34（4）：308－311.

［7］ 張標，曾曉榮，楊艷，等.慢性房顫患者心房肌細胞乙酰膽堿敏感鉀通道的研究［J］.中國病理生理雜志，2006，22（4）：678－682.

［8］ 張瑜，曾曉榮，楊艷，等.持續性心房顫動患者IK1電流密度及其基因表達變化的研究［J］.中華心血管病雜志，2006，34（1）：33－37.

［9］ 王偉，肖穎彬，程偉.快速電場起搏對心房肌細胞電生理特性的實驗研究［J］.重慶醫學，2010，39（14）：1792－1793.

［10］Ozgen N，Dun W，Sosunov EA，et al.Early electrical remodeling in rabbit pulmonary vein results from trafficking of intracellular SK2channels to membrane sites［J］.Cardiovasc Res，2007，75（4）：758－769.

［11］Diness JG，S?rensen US，Nissen JD，et al.Inhibition of small－conductance Ca2＋－activated K＋channels terminates and protects against atrial fibrillation［J］.Circ Arrhythm Electrophysiol，2010，3（4）：380－390.

［12］李妙齡，李濤，雷明，等.持續性心房顫動患者心房肌細胞小電導鈣激活鉀通道電流的增強［J］.中華心血管病雜志，2011，39（2）：147－151.

［13］Li N，Timofeyev V，Tuteja D，et al.Ablation of a Ca2＋－activated K＋Channel（SK2Channel）results in action potential prolongation in atrial myocytes and atrial fibrillation［J］.J Physiol，2009，587（Pt 5）：1087－1100.

［14］Chua SK，Chang PC，Maruyama M，et al.Small－conductance calcium－activated Potassium Channel and recurrent ventricular fibrillation in failing rabbit ventricles［J］.Circ Res，2011，108（8）：971－979.

［15］紀曉花.標本因素對ELISA測定結果的影響［J］.中國醫學創新，2011，8（7）：133－134.