STC1及鈣、磷離子在氟中毒致大鼠腎損傷中的作用

張永春，吳小候△，羅春麗

（1.重慶醫科大學附屬第一醫院泌尿外科 400016；2.重慶醫科大學檢驗系 400016）

腎臟是機體排氟最主要的臟器，也一直是氟中毒非骨相系統研究的熱點，但其損傷機制仍未闡明。鈣、磷離子的正常代謝對腎臟功能的正常運行非常重要，鈣、磷離子相關的調控蛋白失穩態與鈣、磷離子相關的信號調節蛋白功能失調是氟中毒損傷機制中重要的組成部分［1－2］。因此，本課題選擇調控鈣、磷代謝的斯鈣素蛋白1（stanniocalcin 1，STC1）作為研究靶點，以Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠作為研究對象，觀察氟中毒大鼠腎損傷時腎組織STC1及鈣、磷離子的變化，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 氟化鈉分析純為北京化工廠產品，人抗鼠STC1抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，胰蛋白酶、逆 轉 錄 聚 合 酶 鏈 反 應 （reverse transcriptase－polymerase chain reaction，RT－PCR）試劑盒為Gibco公司產品，總RNA抽提試劑Trizol購自上海申能博彩生物科技有限公司，STC1與甘油醛－3－磷酸脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由北京賽百盛公司合成；主要儀器包括：低溫離心機（Sigma 3－18k）、PCR 儀（Astec PC808）、凝膠成像分析系統（Syngene）及酶標儀（Bio－RAD model450）等。

1.2 實驗動物與分組 24只SD雄性大鼠購自貴陽醫學院實驗動物中心，合格證號：SCXK（黔）2002－0001，體質量約80～100g，將其分為4組，每組6只，采用腹腔注射氟化鈉溶液（按體質量比例）的方式為大鼠染氟。（1）對照組，注射生理鹽水；（2）低氟組，注射氟化鈉溶液5mg／kg；（3）中氟組，注射氟化鈉溶液10mg／kg；（4）高氟組，注射氟化鈉溶液20mg／kg。注射頻次為每48h注射1次，自由進食鼠餌，飲用蒸餾水，建模周期為16周。采用股動脈放血法處死大鼠，左腎固定包埋，右腎迅速置于－80℃低溫保存，待用。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 腎組織STC1蛋白的檢測 大鼠左腎經4%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片（厚4μm），脫蠟，用新鮮配置的3%過氧化氫滅活內源性過氧化氫酶15min，微波爐加熱15min進行修復抗原，自然冷卻。采用第一抗體（人抗鼠STC1抗體）、第二抗體（羊抗人IgG）、鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶（streptavidin－perosidase，SP）溶液進行免疫組織化學檢測、用二氨基聯苯胺（3，3′－diaminobenzidine，DAB）顯色3～5min，蘇木素復染、脫水、透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，對氟中毒大鼠腎組織STC1蛋白表達進行分析和定位。免疫組織化學檢查結果根據染色陽性細胞數和染色強度分別評分，以隨機200倍視野5個陽性細胞數所占百分比計分：≤5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度：無染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。染色陽性細胞數和染色強度分值的乘積大于1分者為陽性，≤1分者為陰性。每個標本鏡下隨機選取5個視野，讀取陽性細胞數，將其與該鏡下細胞總數相比，計算陽性表達細胞所占百分比作為陽性率。

1.3.2 腎組織STC1mRNA的檢測 將低溫保存的24例右側腎臟緩慢復溫，在腎臟中部橫斷面剖開，取組織約50mg，按Trizol試劑說明書提取總RNA。cDNA第一鏈的合成（反轉錄）：所有標本各取5μg RNA，65℃預變性5min后，根據RTPCR試劑盒說明書進行cDNA第一鏈的合成。STC1引物：上游5′－ATG CTC CAA AAC TCA GCA GTG AT－3′，下游5′－GGG AGA GTC CCC CTC ACC TCG GAG GT－3′；β－actin引物：上游5′－ATG GAT GAC GAT ATC GCT GCG CT－3′，下游5′－CTC AAA CAT GAT CTG GGT CAT CTT TTC A－3′。PCR擴增參數：95℃預變性5min后，95℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸30s，共35個循環；最后72℃延伸5min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠鑒定，80V電泳40min，用凝膠成像系統掃描并記錄結果，以肉眼明確判定有226bp條帶為陽性標準。

1.3.3 腎組織鈣、磷含量的檢測 將24例右側腎臟緩慢復溫，每例取0.5g，加入混合酸（HNO3∶HClO4＝4∶1）6～10mL，冷消解24h后，放于電流板上加熱消化，于組織溶解液中加入混合酸并加熱，以產生較多白煙為終點。鈣含量使用原子吸收分光光度計分析，磷含量使用鉬蘭比色法分析。

1.4 統計學處理 應用SPSS13.0軟件進行統計學分析，計量數據用±s表示，組間比較采用t檢驗及方差分析，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 染毒大鼠腎組織STC1蛋白的表達 對照組大鼠腎組織中偶可見STC1蛋白的表達，但表達強度和數量很少。3個實驗組均可見到不同程度的STC1蛋白表達，且隨著染氟濃度的增加，STC1蛋白的陽性表達強度和數量增加，STC1蛋白的表達主要定位于腎臟皮髓交界的近曲小管，見圖1、表1。在高氟組大鼠中有2例發現遠曲小管有少量表達，但為了回避假陽性和統計分析的定位統一性，未予列舉和分析。

2.2 染氟大鼠腎組織中STC1mRNA的表達 RT－PCR檢測結果顯示，3個染氟組大鼠腎組織中STC1mRNA的表達水平均明顯高于對照組（P＜0.05），染氟組大鼠腎組織中STC1 mRNA的表達隨著染氟劑量的增加而增強（P＜0.05）。見圖2、表2。

圖1 各組大鼠腎臟STC1蛋白的表達（免疫組織化學）

表1 各組大鼠腎組織STC1蛋白的表達

2.3 染氟大鼠腎組織的鈣、磷含量 各染氟組大鼠腎組織中鈣含量均比對照組增加（P＜0.05），且隨著染氟劑量的遞增，鈣含量也顯著升高。磷含量在各染氟組大鼠腎組織中表現不同，低氟組及高氟組大鼠腎組織磷含量明顯低于對照組（P＜0.05），而中氟組大鼠腎組織磷含量較低氟組及高氟組高（P＜0.05），且與對照組比較，沒有顯著降低（P＞0.05）。見表3。

圖2 STC1及β－actin mRNA的RT－PCR電泳圖

表2 各組大鼠腎組織STC1mRNA的表達（±s）

表2 各組大鼠腎組織STC1mRNA的表達（±s）

組別 n 灰度值對照組6 0.51±0.36低氟組 6 1.89±1.75中氟組 6 3.23±1.19高氟組6 4.62±2.11

表3 各組大鼠腎組織的鈣、磷含量（±s，μg／g）

表3 各組大鼠腎組織的鈣、磷含量（±s，μg／g）

＊：P＜0.05，＃：P＞0.05，與對照組比較；△：P＜0.05，與中氟組比較。

組別 n 鈣含量 磷含量對照組6 55.2±3.31 2.32±0.12低氟組 6 69.7±5.27＊ 1.87±0.11＊△中氟組 6 93.4±2.52＊ 2.29±0.19＃高氟組 6 114.8±9.63＊ 1.79±0.26＊△

3 討 論

STC1是一種作用于線粒體的糖蛋白激素，最初僅在硬骨魚和軟骨魚中發現，1995年 Wagner等［3］用鮭魚的STC抗血清證明人類同樣存在STC。在哺乳動物中，STC1多定位于腎臟、前列腺、卵巢及甲狀腺組織。在大鼠腎臟中，STC1主要表達于近曲小管［4］，其主要功能是調節腎臟的鈣、磷離子代謝［5］，并與腫瘤細胞的凋亡有關，哺乳動物腎組織STC1蛋白的表達會受細胞外鈣離子濃度及1，25－二羥維生素 D3的影響［6－7］，目前其生理功能尚未完全闡明。鑒于STC1具有調節腎臟鈣、磷代謝的功能，本實驗將其引入作為氟中毒腎損傷的研究靶點，從實驗結果來看，隨著染氟劑量的增加，STC1蛋白和mRNA的表達逐漸增加，并且其增加的幅度具有顯著性；STC1蛋白主要定位于腎臟皮髓交界的腎小管上皮細胞。

鈣、磷離子及相關蛋白的含量和功能失衡一直是氟中毒研究領域的一項重要內容，早在1948年國外學者就發現了氟中毒與鈣元素的關系，長時間接觸氟會導致人體鈣離子代謝平衡失調，有研究指出鈣在氟中毒的細胞損傷機制中發揮重要作用［1］。鈣離子在細胞內、外信號轉導機制中發揮觸發點和調節劑的作用，協調、整合不同類型細胞的信號轉導功能［8］。而氟中毒會影響不同類型細胞的鈣離子含量，且這種改變與鈣離子受體、鈣調蛋白、鈣泵及鈣離子通道等密切相關［2］。

有人發現慢性氟中毒可造成大鼠腎臟各種細胞膜鈣泵相關蛋白的減少［9］，但也有研究發現，氟中毒可使腎小管上皮細胞鈣離子相關蛋白表達水平增高［10］，后繼研究表明G蛋白途徑可能是上述改變的機制之一［11］。相似的矛盾現象在心肌網狀組織中也有發現，即氟既可以抑制心肌網狀組織鈣泵，又可刺激鈣泵的功能和表達，這種不同的改變可能取決于鈣泵處于何種易感狀態［12］。由于高爾基體和過氧化物酶體與鈣離子關系密切，所以有學者指出，不同類型組織氟中毒損傷后鈣離子相關蛋白的改變應考慮高爾基體和過氧化物酶體的改變狀態和反應途徑［13］。

鈣、磷在代謝平衡中是相互關聯的，特別是在維持腎臟的正常生理功能方面［14］。目前，對氟中毒損傷機制中磷元素變化的研究并不多，1995年曾有學者對氟中毒過程中鈉、磷代謝的改變進行研究，發現氟中毒會導致磷元素含量改變，相關信號轉導蛋白功能失調［15］。慢性氟中毒會導致 Na＋－K＋－ATP酶的損傷和表達失調，使磷離子的功能失常，影響細胞信號轉導功能［16］，氟中毒的這種影響在腎小管上皮細胞、腎臟髓袢升枝粗段細胞中也有發現［17－18］。

本實驗對氟中毒大鼠腎組織中鈣、磷離子的含量進行了檢測，鈣離子含量隨著染氟劑量的增加而升高，符合氟中毒鈣矛盾性疾病的學說。但磷離子的改變卻沒有規律，中氟組出現了磷離子含量的回升，這種改變經過重復鈣、磷檢測均未獲得扭轉，這從另一個角度提示磷離子在氟中毒腎損傷中的改變可能與相關基因、蛋白的易感狀態有關，這為下一步的深入研究指出新的途徑。STC1的功能主要是調節鈣、磷代謝，其本身也受到鈣離子濃度的調控。在本研究中，STC1的表達上調是否由鈣離子引起或是氟中毒直接造成，還需從基因層面進行研究，探討STC1是否作為氟中毒損傷機制中的一個環節，以揭示氟中毒發生機制，防控氟中毒疾病。

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