5種中藥不同組合抑制小鼠S180肉瘤及抗血管生成作用的比較研究*

楊 峰，高啟龍，姚亞民，劉曉莉，田同德

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，鄭州 450008)

隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，中醫(yī)藥對腫瘤的影響也從免疫功能調(diào)節(jié)研究發(fā)展到新的治療靶點——抗腫瘤血管生成。隨著對腫瘤血管形成機(jī)制的深入研究和其抑制劑的開發(fā)，許多學(xué)者開始研究中醫(yī)藥抗腫瘤血管生成作用，雖然研究血管生成的方法、藥物很多，但缺乏明確的療效和機(jī)制及用于臨床抗血管生成的中藥。尤其是目前對中藥抗血管生成的研究側(cè)重于中藥單體或單味中藥研究，復(fù)方中藥研究血管生成的很少，即使有也是對中藥成方的驗證。在前期研究中，我們從文獻(xiàn)中篩選出19種抗血管生成的中藥單體，又運用雞胚絨毛尿囊膜法對這19種中藥單體抗血管生成的功效進(jìn)行了比較，確定了藤黃酸、人參皂苷、斑蝥素、青蒿琥脂、苦參堿這5種中藥抗血管生成能力最強(qiáng)。還運用雞胚絨毛尿囊膜法和體外抗血管生成法，比較了這5種中藥不同組合抗血管生成的效果。本研究繼續(xù)運用小鼠體內(nèi)腫瘤實驗進(jìn)一步比較這5種中藥不同組合的抗腫瘤血管生成作用，從而開發(fā)出確有療效的抗腫瘤血管生成中藥復(fù)方新藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細(xì)胞 清潔級健康雌性昆明小鼠，4～6周齡，體重25g±3g，購自鄭州大學(xué)河南省實驗動物中心(合格證號2011-097)。分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水，飼養(yǎng)間溫度控制在21℃ ±2℃，相對濕度控制在50%～60%。小鼠S180肉瘤細(xì)胞株購自中科院上海生化細(xì)胞所。

1.1.2 藥物與試劑 藤黃酸、人參皂苷、斑蝥素、青蒿琥脂、苦參堿均購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，沙利度胺為常州第四藥廠有限公司產(chǎn)品。兔抗鼠 CD31抗體購自美國 Biolegend公司，SABC試劑盒及DAB購自中科院上海細(xì)胞所，由河南省腫瘤研究所儲存。

2 方法

2.1 荷瘤小鼠模型的建立

冷凍保存的腹水型S180細(xì)胞體外復(fù)蘇，2000r/min離心5 min棄上清液，用無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整瘤細(xì)胞至2×109/L，取5只健康昆明種小鼠，每只用上述細(xì)胞懸液0.4ml，ip，7d～10d后接種小鼠腹部明顯增大、凸出。將其麻醉處死，無菌抽取乳白色腹水液，以生理鹽水1∶1稀釋，經(jīng)臺盼藍(lán)染色后計算活細(xì)胞數(shù)95%，調(diào)整瘤細(xì)胞密度為2×109/L，64只小鼠右后肢腹股溝部皮下接種0.2ml，4d～5d后形成直徑約6mm大小皮下腫瘤的小鼠作為荷瘤鼠。

2.2 分組與給藥

建立荷瘤小鼠模型并隨機(jī)分為7組，每組8只。A組:生理鹽水組;B1-5組:為5種中藥的不同組合，劑量分別為藤黃酸32mg/kg/d，斑蝥素2mg/kg/d，人參皂苷 20mg/kg/d，青蒿琥脂 50mg/kg/d，苦參堿50mg/kg/d。按上述劑量給藥組合如下:B1組:藤黃酸、人參皂苷、斑蝥素;B2組:藤黃酸、人參皂苷、青蒿琥脂;B3組:斑蝥素、人參皂苷、青蒿琥脂;B4組:藤黃酸、人參皂苷;B5組:藤黃酸、苦參堿;C組:沙利度胺50mg/kg/d。取上述7組藥物灌胃，連續(xù)10d。

2.3 各組腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量觀察

給藥結(jié)束第2天處死小鼠，測量小鼠腫瘤質(zhì)量與體積，腫瘤體積公式V=長×寬 ×0.5計算，并取腫瘤稱重。腫瘤抑制指數(shù)H=(V對照組-V實驗組)/V對照組×100%。

2.4 各組腫瘤微血管密度檢測

處死小鼠，切取腫瘤組織、固定、包埋、切片，行免疫組化檢查。免疫組化檢查采用SABC法，按試劑盒操作說明進(jìn)行。一抗為兔抗鼠CD31抗體，用PBS代替一抗作為陰性對照，瘤旁正常組織作為陽性對照。計數(shù)方法選擇腫瘤組織細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)孤立的棕黃色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇或血管腔內(nèi)徑小于8個紅細(xì)胞者代表一條單獨的微血管。先在低倍視野下找到腫瘤組織內(nèi)微血管密度最高的區(qū)域，然后在200倍視野下計數(shù)5個視野的微血管數(shù)目，取平均值，計算微血管密度。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

4 結(jié)果

4.1 5種中藥不同組合對小鼠S180肉瘤生長的抑制作用及抑制率

表1顯示，A組移植瘤體積增長較快，而各治療組移植瘤體積增長緩慢，C組和B1組最明顯。實驗結(jié)束時各組裸鼠的體重?zé)o明顯差別，與實驗前比較有增長但改變不明顯，B1到B5組移植瘤平均體積和平均瘤質(zhì)量與A組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。根據(jù)腫瘤質(zhì)量和體積計算，B1組藥物對小鼠S180肉瘤生長抑制率分別為45.80%和45.31%，各治療組小鼠飼養(yǎng)中未見藥物不良反應(yīng)。

4.2 5種中藥不同組合對小鼠S180肉瘤血管生成的影響

表1顯示，經(jīng)抗 CD31抗體免疫組織化學(xué)染色，陽性信號位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，腫瘤組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕色或棕黃色。各組移植瘤均有 CD31標(biāo)記的新生血管表達(dá)，腫瘤組織邊緣 MVD高于中央。以 A組中 MVD最高達(dá)39.92±7.97，從 B1到B5組 CD31表達(dá)逐漸減少，C組 MVD最低 僅為17.45±3.99。由5種中藥不同組合的 B1到 B5組與 A組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)。

表1 5種中藥不同組合對小鼠S180肉瘤及血管生成的抑制作用(±s，n=8)

表1 5種中藥不同組合對小鼠S180肉瘤及血管生成的抑制作用(±s，n=8)

注:#P ＜0.05，compared with NS group;MVD:microvessel density;IR:Inhibition rate;TV:Tumor volume;TW:Tumor weight

Group TV(cm3) TVIR(%) TW(g) TWIR(%)MVD A 1.31±0.59 0 1.92±0.79 0 39.92±7.97 B1 0.71±0.23* 45.80 1.05±0.42# 45.31 20.42±5.24#B2 0.72±0.35△ 45.04 1.09±0.57# 43.23 23.50±6.79#B3 0.74±0.49 43.51 1.12±0.48# 41.67 25.16±7.06#B4 0.75±0.31 42.73 1.19±0.74# 38.02 26.77±4.93#B5 0.79±0.65# 39.69 1.23±0.69# 35.94 29.77±5.71#C 0.67±0.42* 48.85 0.98±0.31# 48.95 17.45±3.99#

5 討論

腫瘤血管生成(Angiogenesis)由 Folkman［1］于20世紀(jì)70年代提出，是實體腫瘤賴以生存的微循環(huán)模式，能為腫瘤提供各種養(yǎng)分，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。若沒有血管形成，腫瘤的營養(yǎng)供給及代謝物排泄僅能靠簡單的物理彌散，這極大限制了腫瘤細(xì)胞生長，腫瘤呈靜息狀態(tài)達(dá)數(shù)月乃至數(shù)年之久，直徑只能維持在2mm～3mm以內(nèi)而不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀［2］。因此，腫瘤血管生成是腫瘤持續(xù)生長、侵襲轉(zhuǎn)移的物質(zhì)基礎(chǔ)。抗血管生成為腫瘤的治療提供了新的契機(jī)，與傳統(tǒng)的腫瘤治療相比它具有特異性強(qiáng)、正常組織不易受損、不易發(fā)生耐藥、抗瘤譜廣等優(yōu)勢。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們試圖尋找抗腫瘤血管生成作用強(qiáng)且毒副作用小的新型抗血管生成藥物，中草藥及其提取物逐漸受到重視。雖然目前研究中醫(yī)藥抗血管生成的文獻(xiàn)很多，但臨床實用確有療效的中藥抗血管生成制劑很少。

我們前期研究運用雞胚絨毛尿囊膜法，從文獻(xiàn)報道中選出具有抗血管生成作用的19種中藥，但這些中藥或提取物都未運用于臨床，原因可能是雖然實驗中具有抗血管生成作用，但臨床應(yīng)用后抑制血管生成效果并不明顯;雖然文獻(xiàn)報道這些藥物具有抗血管生成效應(yīng)，但并沒有進(jìn)行比較哪些中藥抗血管生成作用最強(qiáng)，以及我們在這些藥物研究的基礎(chǔ)上如何研發(fā)出抗腫瘤血管生成作用更強(qiáng)的藥物并能運用于臨床。從文獻(xiàn)報道來看，這19種中藥提取物都具有抗血管生成的作用，沒有比較就沒有鑒別，沒有比較就不能開發(fā)出切合臨床實用的抗血管生成中藥新藥。前期研究結(jié)果表明(另行發(fā)表)，去甲斑蝥素、人參皂苷、苦參堿、青蒿琥脂、藤黃酸5種中藥對CAM血管生成具有明顯的抑制作用，表現(xiàn)為 CAM新生血管密度降低，管徑變細(xì)，血管分布雜亂，部分血管出現(xiàn)斷裂，顏色變淺。CAM照片經(jīng)計算機(jī)分析表明，5種中藥抑制血管生成能力的順序為藤黃酸＞人參皂苷＞青蒿琥脂＞苦參堿＞斑蝥素。

為進(jìn)一步提高中醫(yī)藥抗腫瘤血管生成的療效，我們在前期研究的基礎(chǔ)上對已經(jīng)篩選出的療效較強(qiáng)的中藥進(jìn)行了重組，希望找到療效較強(qiáng)的抗腫瘤血管生成的中藥組合。根據(jù)實驗結(jié)果，藤黃酸、人參皂苷、斑蝥素組合抗腫瘤血管生成能力最強(qiáng)，藤黃酸、人參皂苷、青蒿琥脂組合次之，第三是斑蝥素、人參皂苷、青蒿琥脂組合，第四是藤黃酸、人參皂苷組合，第五是藤黃酸、苦參堿組合。在抗腫瘤血管生成效應(yīng)最強(qiáng)的這一組合中的藥物，已有文獻(xiàn)報道這些藥物對多種腫瘤都有抗血管生成作用，其中藤黃酸抗血管生成的能力較強(qiáng)，這與Yi T等的研究結(jié)果一致［3］。人參皂苷也有明確的抗血管生成作用［4］，去甲斑蝥素對乳腺癌和膽囊癌也都有明顯的抗血管生成效應(yīng)［5、6］，這為我們進(jìn)一步的臨床研究奠定了深厚的基礎(chǔ)。

因此，有效的抗腫瘤中藥的篩選、提煉和重組，給抗腫瘤血管生成治療開辟了新的前景，但中醫(yī)藥抗腫瘤血管生成的研究還有很多問題需要解決。主要有多味中藥的不同組合及1味藥在多個方劑中抗腫瘤血管生成的作用機(jī)制是什么?為什么單純中藥抑制腫瘤血管生成療效欠理想?中藥的作用效力如何提高?因此筆者認(rèn)為，我們的下一步任務(wù)是在當(dāng)前中醫(yī)藥抑制血管生成進(jìn)展基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究手段，繼續(xù)對能抑制血管生成的中藥單體進(jìn)行篩選、重組和研發(fā)，使我們更進(jìn)一步地對當(dāng)前的科研成果進(jìn)行總結(jié)和升華，深入挖掘中醫(yī)藥抑制腫瘤血管生成的優(yōu)勢和潛能。而多層面、多學(xué)科相結(jié)合將中醫(yī)藥抗腫瘤血管生成機(jī)制研究推向一個新的水平，開發(fā)出有確切療效且能在臨床上應(yīng)用的中藥單體或復(fù)方血管生成抑制劑，以進(jìn)一步提高腫瘤的治療效果，延長患者的生命，從而使中醫(yī)藥更好地為廣大腫瘤患者服務(wù)。

［1］Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications［J］.N Engl J Med，1971，285(21):1182-1186.

［2］Folkman J， BronderT， Palmblad J， etal. Angiogenesis research:guidelines for translation to clinical application［J］.Thromb Haemo，2001，86(4):23-33.

［3］Yi T，Yi Z，Cho S-G，et al.Gambogic acid inhibits angiogenesis and prostate tumor growth by suppressing vascular endothelial growth factor receptor 2 signaling［J］.Cancer Research，2008，68(6):1369-1377.

［4］辛穎，姜新，崔俊生，等.20(S)-人參皂苷 Rg3對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用［J］.腫瘤防治研究，2010，37(12):1352-1355.

［5］范躍祖，陳春球，趙澤明.去甲斑蝥素對膽囊癌腫瘤血管生成的作用及機(jī)制研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，92(10):693-699.

［6］林曉燕，宋和平，胡赟宏.去甲斑蝥素對人乳腺癌血管生成的抑制作用［J］.中國癌癥雜志，2007，17(11):847-850.